Морфофункционално изследване върху ефектите от пасивното пушене в бъбреците на плъхове
Feb 19, 2022
ВЪВЕДЕНИЕСпоред Световната здравна организация (СЗО) тютюнопушенето е водещата причина за предотвратима смърт в света, засягайки 8 милиона души годишно, като приблизително 1,2 милиона от тези смъртни случаи са резултат от лица, изложени на пасивно пушене. (1) Цигарите се състоят от хиляди химически компоненти, наскоро изчислени на 5600. Сред тях 158 притежават токсикологични свойства, способни да замърсят околната среда чрез дим (2), който при вдишване от пасивния пушач съдържа шест пъти повече никотин, четири пъти повече катран, седем пъти повече въглероден окис и 73 пъти повече амоняк от които се вдишват от активния пушач. (3)
Сравнително проучване, проведено от Dülger et al., (4) сред група членове на семейства на пушачи и доброволци, които не са били подложени на цигарен дим, показа,бъбречни функции са компрометирани от активното пушене. Въпреки това, Elihimas Júnior et al., (5) посочи, че излагането на цигарен дим също може да бъде мощнобъбректоксичен агент. Jain et al., (6) демонстрират, че никотинът е мощен стимул за пролиферация на човешки мезангиални клетки и производство на фибронектин, утежнявайки гломерулното увреждане.
По този начин пушенето и циркулиращият никотин влияят отрицателно върху структурите, отговорни за гломерулната филтрация, но връзката между пасивното пушене и морфофункционалните промени на тези структури, дължащи се на тази експозиция, все още не е напълно изяснена в литературата и това е основната цел на настоящото изследване.
Ключови думи:Замърсяване с тютюнев дим; Бъбречна кора; Бъбречни гломерули; мезангиални клетки; Диабетни нефропатии; Скорост на гломерулна филтрация; Плъхове, Wistar
ОБЕКТИВЕНДа се анализират морфологичните, структурните и функционалните аспекти набъбрецина плъхове след пасивно вдишване на цигарен дим.
МЕТОДИГрижите и настаняването на животните бяха в съответствие с Националните и институционални насоки за хуманно отношение към животните, създадени от Colégio Brasileiro de E xperimentação Animal (COBEA) [Бразилски колеж за експерименти с животни] и Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) [НационаленСъвет за контрол на опитите с животни]. Всяко използване на животни беше прегледано и одобрено от Комитета по етика при експерименти с животни (процес 286/2015). Ето защо бяха положени усилия за минимизиране на страданието, дискомфорта и броя на използваните животни, като се третират хуманно с тях.
Уча дизайнЕкспериментално изследване, съставено от мъжки плъхове (Rattus norvegicus albinus), на възраст {{0}} седмица, със средно тегло 260 g, разделени на контролна група (CG) и група пасивни пушачи (SG). CG и SG бяха подразделени на CG 7 дни (n=10), SG 7 дни (n=10), CG 28 дни (n=10) и GT 28 дни (n{ {10}}). Животните от двете групи бяха държани във вивариума на Faculdade de Medicina de Jundiaí (FMJ), от ноември 2015 г. до януари 2016 г., в отделни помещения, по две в кутия, при стайна температура между 22±2 градуса и светло/тъмно цикъл от 12 часа. Наддаване на тегло на животните (g) и прием на филтрирана вода (mL) и храна (g) ad libitum (Nuvilab ®; енергийна стойност: 339 kcal=1418kJ 100,0 процента; въглехидрати 54 g или 63,4 процента; протеини 22 g или 25,9 процента; и липиди 4 g или 10,6 процента - количества на порция от 100 g и процент от общата енергийна стойност) бяха наблюдавани по време на експеримента. Разликите между предложеното количество и пренебрегнатото от животното количество бяха използвани за изчисляване на средния прием.
За да се адаптират към цигарения дим, животните от SG бяха постепенно изложени на изгаряне на цигари, което се случи на две, до 40 цигари на ден (висок добив; катран: 10 mg; никотин: 0,8 mg; въглероден окис: 10 mg) за периоди от седем до 28 дни. Изгарянето е станало в автоматична машина за пушене (SM-MC-01), програмирана да започва да изгаря цигари на всеки 6 часа, с изгаряне на 10 цигари на цикъл. Цигареният дим се аспирира от входящата система на вентилационния стелаж, така наречената "стая за пушене" (Фигура 1), и се разпределя хомогенно вътре в запечатаните боксове на животните. Въглеродният диоксид се измерва вътре в кутиите и в средата, където са държани CG и SG животните, като се използва калибриран измервател на въглероден диоксид (AZ Instruments, модел AZ 77535, сериен номер 10109975) (сертификат 00948/2016).
Обем на урината и анализ на биохимичните показателиНа 6-ия и 27-ия ден, животните бяха поставени в метаболитни клетки за събиране на 24--часова урина. Скоро след това те бяха претеглени, анестезирани, евтаназирани чрез продължителна анестезия ибъбреции кръвта е събрана. Микроалбуминурията се измерва чрез имунотурбидиметрия, чрез спектрофотометричен анализ. Беше извършено измерване на плазмения креатининов клирънс (референтна стойност: {{0}}.58±0.24mg/dL) (7) и креатининовия клирънс в урината (референтна стойност: 67.2±12.8mg/dL) (7) по метода на Джафе. (8) За анализи на креатинин и глюкоза (референтна стойност: 108±17,4 mg/dL), (7) пробите се центрофугират при 3,000rpm, за десет минути, при 4 градуса, за да се получи серум. След това бяха използвани ензимни комплекти за измерванията в Laborlab за креатинин, Bioclin за глюкоза и Analisa за микроалбуминурия.
Тегло, размери и хистология на бъбрецитеTheбъбрециполучени от животните бяха дисектирани и претеглени на аналитична скала (модел AB204, Mettler Toledo, Barueri, SP, Бразилия). Theбъбрекразмерите (дължина, ширина и височина) са получени с помощта на пахиметър и техните радиуси (r) са използвани за определяне набъбрекобем в кубични сантиметри с помощта на формулата vol=4/3π (r1.r2.r3), използвана за изчисляване на обема на елипса. (9) За хистологичен анализ, вдяснобъбрек(RK) беше изрязан хоризонтално междубъбречнаполюси, а левиятбъбрек(LK) имаше напречно сечение, краниално и каудално набъбрекхилусни срезове, като централната секция се използва за анализите. Тъканните срезове бяха поставени в парафин, нарязани с дебелина приблизително 4 μm и оцветени с хематоксилин-еозин (HE) и периодична киселина на Шиф (PAS).
Морфометрия и стереоология Измерванията набъбречнаcortex бяха получени с калибриран милиметров окуляр, прикрепен към оптичен микроскоп Motic с 4X обективна леща, върху хистологични слайдове на RK и LK, оцветени в HE.
Цялото морфоколичествено изследване на тъканите на структурно ниво е извършено с помощта на софтуера Motic Images Plus 2.0 за анализи и дигитализация на хистологичните срезове. За количествено определяне на гломерулната плътност на групите, изображения набъбречнакора на главния мозък са уловени с 4X обектив върху хистологични слайдове, оцветени в HE. На изображението в 15 полета на LK и 20 полета на RK е поставена тестова система, образувана от мрежата и референтните пресечни точки, които са общо 100 точки, като се броят тези, които са фокусирани върху гломерулите, и изключват тези, фокусирани върху прекъснатите линии (Фигура 2). Гломерулната плътност по отношение на тестовата система се изчислява, както следва: Vv[glom] =p/P (Vv[glom]), с гломерулна плътност в проценти; p са точките на гломерулите, а P е общият брой точки в тестовата система. (10)
За изчисляване на гломерулния и капсулния диаметър на изображенията, заснети с 40X обектив върху слайдовете
оцветени с PAS, между краищата на тези структури бяха начертани линии със стойността, изчислена от програмата (в μm). Средният диаметър е получен след осредняване на най-големия и най-малкия диаметър на споменатите структури, в 40бъбречнателца в RK и 30 в LK, в които се наблюдават съдови и/или уринарни полюси (Фигура 3А). Капсулните пространства са получени чрез разликата между техните стойности.
В същите тези гломерули, сега с обектив 60Х, тестовата система беше поставена отново и точките, които се появиха на гломерула, бяха преброени. Веднага след това се преброяват точките, които попадат върху ядрата на мезангиалната клетка; (9) те бяха групирани в мезангиално пространство, заобиколено от мезангиална матрица между гломерулните капилярни бримки (11) (Фигура 3B). Обемните фракции, заети от мезангиалната клетка
по отношение на тестовата система (гломерул) се изчисляват, както следва: Vv[mesg]=p/P (Vv[mesg], с мезангиална обемна плътност, дадена като процент, p е показателно за точките върху ядрата на мезангиалните клетки и P, съответстващ на общия брой точки в тестовата система.(8)
Статистически анализСтатистическият анализ беше извършен с цел да се направят сравнения между CG и SG, както и вътрешногрупови сравнения за всяка от изследваните променливи, като се използват средни стойности и стандартни отклонения. Данните бяха подложени на дисперсионен анализ (ANOVA). Предположението за хомогенност на дисперсиите беше проверено чрез прилагане на теста за множество сравнения на Tukey. Нивото на значимост, прието за всички тестове, беше p По-малко или равно на 0.05. Софтуерът, използван за анализ, беше Biostat 5.3 (Instituto de Desenvolvimento Sustentável Mamirauá, Belém, PA, Бразилия) и бяха направени сравнения както между CG и SG, така и вътрешногрупови.
РЕЗУЛТАТИ
Нива на въглероден диоксид (част на милион)Ефикасността на оборудването на стаята за пушене при генериране и вдухване на дим беше потвърдена чрез откриване на нивата на въглероден диоксид. Първоначалната средна стойност преди изгаряне на цигара беше 620.8 части на милион (ppm) в SG среда, което беше близо до средната стойност, получена в CG среда (571.8ppm). Тъй като цигарите бяха запалени и димът се вдухваше в кутиите, нивата на въглероден диоксид нарастваха прогресивно от минимална средна стойност от 616,6 ppm до максимална средна стойност от 1267.0ppm (p По-малко или равно на 0,01).
Наддаване и прием на телесно тегло Животните SG показват по-ниско наддаване на телесно тегло и по-нисък прием на храна и вода през изследваните периоди (Таблица 1).
Морфометрия: тегло и размери на бъбрецитеИмаше значителни намаления на средните стойности забъбректегло,бъбрекразмери (дължина, ширина и височина),бъбрекобем и кортикална дебелина при SG животни през изследваните периоди. Нямаше разлика по отношение на дължината на RK и в двата периода и височината на LK в седемдневния период (Таблица 2).
Морфометрия и стереоология на бъбречните телцаЩо се отнася до гломерулната обемна плътност и гломерулните и капсулните диаметри, средните стойности, наблюдавани в SGбъбрецибяха значително по-ниски. По отношение на капсулните пространства, средните стойности, наблюдавани в SG, са значително по-високи през периода от 28 дни. По отношение на плътността на мезангиалния обем, зает от мезангиалната клетка в гломерулите, средните стойности в SG са значително по-високи (Таблица 3 и Фигура 4).
Обем на урината и анализ на биохимичните показатели
Обемът на урината на SG животните е значително по-нисък на седем дни и няма разлика на 28 дни. Нивата на глюкоза, креатинин и микроалбуминурия на SG животни са значително по-високи, а нивата на креатинин в урината и скоростта на креатининов клирънс при SG животни са значително по-ниски по време на изследваните периоди (Таблица 4).
ДИСКУСИЯ
В настоящото изследване въглеродният диоксид е използван за проверка на степента на замърсяване на околната среда от цигарен дим. Нивата на този газ в кутиите на SG животни са подобни на тези, открити от Colli Neto et al., (12), които наблюдават нива на концентрация на въглероден диоксид над 999ppm. Това показва, че компонентите, присъстващи в цигарения дим, са циркулирали и животните са ги вдишвали. Освен това, работата на Robello (13), използвайки подобен метод на експозиция, идентифицира високи нива на котинин (метаболит на никотин) в серума на животни от SG.
Поради тази експозиция, SG животните показват по-ниско наддаване на тегло през изследваните периоди, поради по-ниския прием на вода и фураж. Вдишването на никотин чрез цигарен дим променя метаболизма, насърчавайки повишеното производство на топлина и консумацията на кислород, което стимулира тироид-стимулиращия хормон (TSH) с последващ повишен метаболизъм и по-високи нива на глюкоза и холестерол в кръвта. (14) Той също така причинява рязко повишаване на концентрациите на допамин и серотонин в мозъка, като по този начин инхибира приема на храна. (15) Една от предложените хипотези за това е умереното ниво на хипергликемия при пушачите, (16) факт, наблюдаван в настоящето проучване и в проучванията на Sinzato et al. (17)
В проучване с плъхове, изложени на тютюнопушене от вътреутробния период, Schiffner (18) отбелязва, че анализът на теста за глюкозен толеранс показва резистентност към действието на инсулина и по-високи глюкозни пикове в тази група в сравнение с контролите, което предполага, че пушачите имат по-големи затруднения при усвояване на глюкоза поради по-ниската наличност на инсулин, по-малкия брой и/или функция на инсулинови рецептори или по-ниския капацитет за индуциране на вътреклетъчната сигнална каскада, което улеснява усвояването на глюкоза.
В резултат на тези фактори,бъбректеглата и размерите в настоящото проучване са били засегнати, кулминирайки с по-малкиобеми на бъбреците, факт, наблюдаван и в експерименталното изследване на Dündar et al. (19) Въпреки това, въпреки че някои морфологични промени може да не означават увреждане набъбречна функция, тази връзка изглежда следва по право пропорционален начин при тютюнопушенето, тъй като се наблюдава значителна атрофия при оценка на кортикалната дебелина в SG. Всъщност връзката между кортикалната дебелина ибъбречна функциясе предполага, особено когато има пропорционално намаляване на гломерулите, (20) също наблюдавано в настоящото изследване, със значително намаляване на размерите набъбречнадиаметър на корпускулите. Въпреки това, капсулното пространство се увеличава в SG, с по-дълго време на експозиция, вероятно поради намаляване на гломерулния диаметър, което позволява произтичащото намаляване на скоростта на гломерулна филтрация (GFR). (19)
При оценката на мезангиалната обемна плътност, имаше значително увеличение при SG животните. Мезангиалните клетки, които помагат и модулират GFR и повърхността на гломерула, благодарение на тяхната способност
да се свива и отпуска в отговор на вазоактивни лекарства, може да претърпи значителна пролиферация, с гломерулна склероза и тубуло-интерстициална фиброза при животни в отговор на гломерулните ендотелни лезии, причинени от тютюнопушенето. (21,22)
Поради наблюдаваните морфологични промени, както и по-ниската консумация на вода от SG животни, също наблюдавани в проучванията на Gonçalves-Silva и др., (23) биохимичните параметри на анализа на кръвта и урината също се променят в SG, осигурявайки субсидии за да разберете възможните щети набъбречна функция, тъй като нивата на креатинина, креатинина в урината и обема на урината, използвани за определяне на степента на креатининов клирънс за оценка на GFR, са значително по-ниски. Тютюнопушенето насърчава значително повишаване на съотношението албумин-креатинин, с промени в гломерулното капилярно налягане и бъбречната функция (24) и има малко проучвания, които корелират никотина в кръвта на пасивните пушачи сбъбречни заболявания, особено по отношение на остра експозиция. (25)
По този начин, острото действие на циркулиращия никотин може да бъде свързано с гломерулна ендотелна дисфункция, тъй като персистиращите нива на микроалбуминурия, значително повишени в това проучване, определят и класифицират началото и прогресията на нефропатия и изразяват рисков фактор за ендотелна дисфункция и увреждане на макро- и микроциркулацията. (26) Cooper (27) демонстрира, че никотинът ускорява нефропатиите, които се откриват чрез увеличаване на микроалбуминурията с прогресия до протеинурия, като заключава, че активното и пасивното пушене са токсични забъбречна функция.
ЗАКЛЮЧЕНИЕИзлагането и пасивното вдишване на цигарен дим от животните предизвиква морфологични и структурни промени в бъбреците им. В съчетание с промените в биохимичните параметри, дължащи се на експозиция, резултатът беше намалена скорост на гломерулна филтрация, което показва, че излагането на пасивно пушене може да компрометирабъбречна функция, с подобни ефекти като тези от активното пушене.