Нефротоксичен потенциал на предполагаемите метаболити на 3,5-дихлороанилин (3,5-DCA) и биотрансформация на 3,5-DCA в изолирани бъбречни клетки от плъхове Fischer 344

За да научите повече, моля свържете се с:tina.xiang@wecistanche.com

Резюме:Настоящото проучване е предназначено да изследва in vitro нефротоксичния потенциал на четири 3,5-дихлороанилин(3,5-DCA)метаболита(3,5-дихлороацетанилид,3,5- DCAA;3,5-дихлорофенилхидроксиламин,3,5-DCPHA;2-амино-4,6-дихлорфенол,2-A-4 ,6-DCP;3,5-дихлоронитробензен,3,5-DCNB) и за определяне на бъбречния метаболизъм на 3,5-DCA in vitro. При тестване за цитотоксичност,изолирани бъбречни клетки(IKC) от мъжки плъхове Fischer 344 (~4 милиона/mL, 3mL) са били изложени на метаболит (0-1.5 mM; до 90 минути) или носител. От тези метаболити 35-DCPHA е най-мощният нефротоксичен, с 35-DCNB междинен нефротоксичен потенциал.2-A-4,6-DCP и 3,{ {12}}DCAA не са цитотоксични. В отделни експерименти цитотоксичността на 35-DCNB беше намалена чрез предварително третиране на IKC с антиоксиданти и инхибитори на цитохром Р450, флавин монооксигеназа и пероксидаза, докато цитотоксичността на 3,5-DCPHA беше отслабена от две нуклеофилниантиоксиданти(глутатион и N-ацетил-L-цистеин). Инкубацията на IKC с 3,5-DCA(0.5-1.0 mm,90 min) произведе само 3,5-DCAA и 3,{{12 }}DCNB като откриваеми метаболити. Тези данни предполагат, че 3,5-DCNB и 3,5-DCPHA са потенциални нефротоксични метаболити и могат да допринесат за индуцирана от 3,5-DCA нефротоксичност in vivo. В допълнение, бъбрекът може да биоактивира3,5-DCNB до токсични метаболити и 3,5-DCPHA изглежда генерира реактивни метаболити, които допринасят за3,5-DCA нефротоксичност. In vitro, N-окислението на 3,5-DCA изглежда е основният механизъм на биоактивиране на 3,5-DCA до нефротоксични метаболити.

Ключови думи:нефротоксичност; инвитро; плъх;3,5-дихлороанилин;35-дихлорофенилхидроксиламин;3,5-дихлороацетанилид;2-амино-4,6-дихлорфенол;3,{{ 9}} дихлоронитробензен

щракнете, за да научите повече информация.

1. Въведение

Хлороанилините са химични междинни продукти, често използвани в производствения процес за много багрила, селскостопански химикали, лекарства и промишлени химикали. Излагането на хлороанилини възниква в професионална среда, чрез тяхното освобождаване или образуване по време на метаболизма при бозайници на многобройни съединения [1-3] или чрез разграждане на пестициди в околната среда[1,4-6]. Откриването на хлороанилини в човешка урина или кръв се използва като биомаркер за излагане на пестициди на основата на хлороанилин [7-10]. Токсичността, свързана с излагане на хлороанилини, включва хематотоксичност (напр. анемия или метхемоглобинемия) [11-13], спленотоксичност [11,14], хепатотоксичност [14-17], ендокринно разстройство [18] и нефротоксичност [16,19 ,20]. Хлороанилините също се считат за приоритетни замърсители в проучванията за оценка на риска за околната среда поради техните потенциални неблагоприятни последици за здравето и освобождаване след разграждане на пестициди в околната среда в земеделски райони [21,22].

Сред трите монохлорирани и шест дехлорирани анилина, 3,5-дихлороанилин (3,5-DCA) е най-мощният нефротоксичен in vivo иинвитро[16,19,23]. Експозицията in vivo на 3,5-DCA в Sprague-Dawley или Fischer, 344 плъха е довела до повишена концентрация на уреен азот в кръвта (BUN), намален транспорт на органични йони в проксималните тубулни клетки, намалено тегло на бъбреците, протеинурия и хематурия [23,24]. Най-сериозните морфологични промени настъпват в проксималните тубулни клетки на бъбреците, но дисталните тубулни клетки и събирателните каналчета също са засегнати от експозицията на 3,5-DCA [23]. Допълнителни проучвания с помощта наизолирани бъбречни клетки(IKC) от мъжки плъхове Fischer 344 демонстрира, че концентрации от 1.0 mm или повече 3,5-DCA експозиция за 90 минути водят до повишено освобождаване на лактат дехидрогеназа (LDH), мярка за цитотоксичност [25 ].

Токсичността на анилиновите съединения in vivo се дължи главно на образуването на токсични метаболити. Въз основа на проучвания с анилин и някои от неговите хлорирани производни, пътищата на биотрансформация за тези анилинови съединения са ясно установени и включват N-окисление, N-ацетилиране и окисление на фенилов пръстен [13,26-28]. Въпреки че in vivo метаболизмът на 35-DCA не е изследван подробно, тези пътища на биотрансформация могат да произведат редица потенциално токсични метаболити (Фигура 1), както се случва с други хлороанилини, където са проведени проучвания за биотрансформация [26, 29,30]. Последните проучвания на Racine et al. [25] са показали, че 35-DCA се метаболизира до токсични метаболити чрез редица бъбречни ензимни системи. Не е ясно обаче кои метаболити се произвеждатбъбреци.

Един потенциален 3,5-DCA метаболит,4-амино-2,6-дихлорофенол (4-A-2,6-DCP) , е оценен за нефротоксичен потенциал и е мощен нефротоксичен in vivo и in vitro при мъжки плъхове Fischer 344 [31-33]. Сравнително in vitro изследване на нефротоксичния потенциал на често моно-, ди- и трихлоронитробензените в бъбречни кортикални срезове установи, че 3,5-дихлоронитробензен (35-DCNB) е най-малко мощният нефротоксичен сред дихлоронитробензените [34] . Към днешна дата понастоящем няма проучвания, които да изследват нефротоксичния потенциал на други предполагаеми 3,5-DCA метаболити.

Настоящото проучване е предназначено да определи нефротоксичния потенциал на три допълнителни предполагаеми 3,5-DCA метаболита, които възникват от N-ацетилиране, (3,5-дихлороацетанилид;

3.5-DCAA), N-окисление (3,5-дихлорофенилхидроксиламин; 35-DCPHA) или окисление на фенилов пръстен (2-амино-4,{{ 8}}дихлорофенол;2-A-4,6-DCP) (Фигура 1) след извънбъбречна биотрансформация на 35-DCA. Бяха изследвани нефротоксичният потенциал на 3,5-DCNB в IKC модела и неговите потенциални механизми на биоактивиране. Освен това беше определен потенциалът свободните радикали/реактивните метаболити да допринесат за цитотоксичността на 3,5-DCPHA. И накрая, беше проведено проучване за биотрансформация, за да се установи до каква степен 3,5-DCA се биотрансформира в IKC от мъжки плъхове Fischer 344 и да се определи кои метаболити се образуват.

2. Резултати

2.1. Връзки между времето и концентрацията на цитотоксичността за 3,5-DCA метаболита

За да се определи нефротоксичният потенциал на всеки 3, 5-DCA предполагаем метаболит, бяха проведени проучвания за концентрация и времеви курс в IKC. Излагането на 3,5-DCAA не повишава значително освобождаването на LDH, маркер за цитотоксичност, по всяко време (60 или 90 минути) или концентрацията (0-1. 5 mM) тествани (Фигура 2А). В допълнение, експозицията на 2-A-4,6-DCP не доведе до значително повишаване на освобождаването на LDH при която и да е тествана концентрация (до 1,5 mM) след 60 или 90 минути експозиция ( Фигура 2B). Инкубирането на IKC с 3,5-DCNB или 3,5-DCPHA доведе до зависими от времето и концентрацията увеличения на освобождаването на LDH и за двете съединения, въпреки че 3,5-DCPHA индуцира най-големите увеличения на Освобождаване на LDH. Значително освобождаване на LDH се наблюдава при 3, 5-DCNB концентрации 1,0 или 1,5.mM или повече след 90 минути, но само при 1,5 mM след 60 минути (Фигура 2C). За разлика от това,35-DCPHA индуцира значително увеличение при освобождаване на LDH при 0,25 mM или повече след 60 и 90 минути, като увеличенията на освобождаването на LDH, наблюдавани на 90 минути, са значително повишени в сравнение със съответните 60 минути увеличения на освобождаването на LDH (Фигура 2D). Следователно, от тестваните метаболити, 3,5-DCPHA е най-нефротоксичен.

2.2. Бъбречна биотрансформация и 3,5-DCNB цитотоксичност

Тъй като анилините и нитробензените могат да се метаболизират един в друг, са предназначени допълнителни проучвания за изследване на ролята набъбречна биотрансформацияи свободните радикали в цитотоксичността след излагане на 1.0 mM 3,5-DCNB за 60 минути. За да се определи потенциалната роля на свободните радикали в 3,5-DCNB цитотоксичността, IKC беше предварително обработен с антиоксидант. Предварително третиране с всички антиоксиданти (-токоферол, глутатион, аскорбат и N-ацетил-L-цистеин; фигура 3) значително отслабва 3,5-DCNB-индуцирана цитотоксичност.

За изследване на ролята на бъбречната биотрансформация при 3,5-DCNB токсичност при IKC е използвано предварително третиране с инхибитори на цитохроми P450(CYPs), флавин-съдържащи монооксигенази (FMOs) и пероксидази. Използването на CYP инхибитори (Фигура 4) показа, че два общи инхибитора на CYP (пиперонилбутоксид [PiBx]; метирапон) значително намаляват цитотоксичността на 3,5-DCNB. Предварителното третиране с инхибитори на FMO (n-октиламин; метимазол) и инхибитора на пероксидазата меркаптосукцинат значително намалява цитотоксичността на 3,5-DCBN (Фигура 5). Индометацинът, който инхибира пероксидазната активност на циклооксигеназата, има тенденция да намалява 3,5-DCNB-индуцираното освобождаване на LDH, но не достига значителна разлика (Фигура 5).

2.3. Антиоксиданти и 3,5-DCPHA цитотоксичност

За да започнем да изследваме ролята на свободните радикали в 3,5-DCPHA-индуцираната цитотоксичност, IKC бяха предварително третирани сантиоксиданти(глутатион, аскорбат или N-ацетил-L-цистеин) преди излагане на 3,5-DCPHA(0.5 mM). Резултатите показват, че за разлика от 3,5-DCNB, 3,{{10}}DCPHA индуцираната цитотоксичност е частично атенюирана с N-ацетил-L-цистеин и напълно защитена от глутатион (Фигура 6 ).Аскорбатът (1.0 или 2,0mM) не е ефективен за намаляване на цитотоксичността на 3,5-DCPHA.

2.4.3,5-Метаболизъм на DCA от IKC

Предишните сравнителни проучвания за цитотоксичност бяха предназначени да изследват нефротоксичния потенциал на предполагаемите 3,5-DCA метаболити, произведени външно. Ние също така изследвахме как IKC метаболизира 3,5-DCA, за да видим кои метаболити се произвеждат директно от бъбречните клетки. В тези експерименти IKC бяха инкубирани или с нетоксична концентрация от 3,5-DCA (0.5 mM) или с цитотоксична концентрация (1.0 mM) за 90 минути и проби от среда и клетки, анализирани чрез HPLC за 3,5-DCA и неговите метаболити. Времената на задържане за 3,5-DCA и неговите метаболити, границите на откриване и коефициентите на екстракция са показани в Таблица 1 за автентични стандарти на 3,5-DCA и всеки метаболит (4-A{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA и 3 ,5-DCNB).

И при двете концентрации основното съединение в средата и клетките в края на инкубационния период беше изходното съединение 3, 5-DCA. По-малко от 5 процента от 3,5-DCA се метаболизират до 3,5-DCAA и 3,5-DCNB (Таблица 2). Няма доказателства за образуването на неконюгирани аминохлорофенолни метаболити 2-A-46-DCP или 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA не беше открит, което не беше изненадващо предвид силно реактивния характер на този метаболит, но констатацията, че 3,5-DCNB присъства в средата и клетките подкрепя заключението, че 3,5-DCPHA е образуван и след това допълнително се окислява до 3,5-DCNB.

Съществува възможност аминохлорфенолите да се образуват, но да се метаболизират до сулфатни или глюкуронидни конюгати. За да се определи дали са образувани конюгати, 3,5-DCA (1.0 mM) се инкубира с IKC за 45 или 90 минути. Въпреки това, третирането на среда или клетъчни лизати с арилсулфатаза или -глюкуронидаза не разкрива никакви свободни 2-A-4,6-DCP или 4-A-2,{ {12}}DCP (данните не са показани). Тези резултати предполагат, че тези два метаболита не са били образувани на откриваеми нива или са били допълнително окислени до реактивни метаболити (Фигура 1). Въпреки това, тъй като по същество е настъпило пълно възстановяване на 35-DCA еквивалентите, малко вероятно е много, ако има такива, от тези метаболити да са образувани отбъбречни клетки.

2.5. Ефект на диетилдитиокарбаминова киселина (DEDTCA) върху 3,5-DCA метаболизма

Предишни проучвания показват, че предварителното лечение на IKC с инхибитори на CYP2C значително намалява 3,5-DCA цитотоксичността [25]. Един от най-ефективните инхибитори на 35-DCA токсичността е CYP2C инхибиторът DEDTCA. За да се изследва как DEDTCA повлиява метаболизма на 3,5-DCA, IKC бяха предварително третирани с DEDTCA (0.1 mM), последвано от {{10}}DCA (1.0mM) за 90 мин. инкубация. Определянето на нивата на 35-DCA и 3,5-DCA метаболити разкри, че общото ниво на 3,5-DCA в средата и клетките е само леко повишено, докато образуването на 3,{{ 20}}DCAA и 3,5-DCNB бяха намалени (Таблица 3). Не беше открит 2-A-4.6-DCP 4-A-2,6-DCP или 3,5-DCPHA, което е в съответствие с по-ранни проучвания (Таблица 2).

3. Дискусия

Важен аспект на това проучване беше определянето на нефротоксичния потенциал на предполагаемите външно произведени метаболити на 3,5-DCA върху бъбречните таргетни клетки. Предполага се, че тези метаболити се образуват въз основа на метаболизма на анилин и хлоранилини (Фигура 1)[13.26,28,29]. По-рано сме изчислили, че нефротоксична доза от 3,5-DCA при плъх Fischer 344 би довела до максимално кръвно ниво от ~1,25 mM [25]. По този начин концентрации на метаболити под тази концентрация могат да бъдат физиологично значими. Резултатите от настоящото проучване показват, че метаболитът, произтичащ от N-ацетилирането на 3,5-DCA, 3,5-DCAA, притежава силно намален нефротоксичен потенциал в сравнение с 3,5-DCA. Този резултат не е изненадващ и е в съответствие с по-ранни проучвания с монохлоранилини и техните метаболити, които показват, че N-ацетилирането води до хлороацетанилидни метаболити с намален нефротоксичен потенциал в сравнение с изходното съединение [35,36]. По този начин N-ацетилирането изглежда е път на детоксикация за индуцирана от хлороанилин нефротоксичност, включително 3,5-DCA. В допълнение, IKC е в състояние да метаболизира 3,5-DCA до 3,{{30} }DCAA (Таблица 2). Но предвид слабия нефротоксичен потенциал на 3,5-DCAA, малко вероятно е този метаболит да допринася за индуцирана от 3,5-DCA нефротоксичност in vitro.

За разлика от 3,5-DCAA, най-малко един метаболит в резултат на окисление на фенилов пръстен на 3,5-DCA предизвиква нефротоксичност. Окисляването на 3,5-DCA в 4-позиция произвежда 4-A-2,6-DCP (Фигура 1), който е мощен нефротоксичен in vivo и in vitro [31-33]. In vivo 4-A-2,6-DCP(0.38 mmol/kg,ip) предизвиква изразена нефротоксичност при мъжки плъхове Fischer 344, характеризираща се с протеинурия, глюкозурия, повишена концентрация на уреен азот в кръвта (BUN) ибъбректегло и проксимална тубулна некроза в сегмента S3 [3132]. In vitro, 4-A-2,6-DCP намалява усвояването на p-амино хипурат (PAH) и тетраетиламоний (TEA) при плъхбъбречни кортикални срезовепри концентрации от 5 μM и 50 uM, съответно 【31】 и повишено освобождаване на LDH при 50 μM или по-високо след 2 часа експозиция 【33】. При IKC са необходими концентрации от 250 μM или по-високи и 90 минути експозиция за 4-A-2,6-DCP за увеличаване на освобождаването на LDH. По-високите концентрации, необходими за индуциране на цитотоксичност в този модел, най-вероятно се дължат на наличието на албумин в инкубационната среда за IKC, но не и в разтвора на Krebs-Ringer, използван при инкубационни изследвания на бъбречен кортикален срез. В това проучване 2-A-4,6-DCP, който е резултат от окисление в 2-позиция на 35-DCA, не повишава освобождаването на LDH при концентрации до 1,5 mM и експозиция до 90, което показва, че 4-A-2,6-DCP е по-мощен като нефротоксичен от 2-A-4, 6-DCP. Това откритие е в съгласие със сравненията на нефротоксичния потенциал на други 4-амино- и 2-аминофеноли[37,38]. Следователно 4-A-2.6-DCP изглежда по-вероятно от 2-A-4,6-DCP да допринесе за 3,{{38 }} DCA-индуцирана нефротоксичност in vivo.

В IKC3,5-проучванията за метаболизъм на DCA, нито 2-A-4,6-DCA, нито 4-A-2,6- DCA бяха открити като свободни метаболити или като глюкуронидни или сулфатни конюгати (Таблица 2). Въпреки че е възможно да са произведени малки количества от тези аминодихлорфеноли, пълно възстановяване на 3,5-DCA, добавени към IKC инкубацията, беше открит като изходно съединение плюс други метаболити (Таблица 2). Тези резултати предполагат, чебъбрекне образува достатъчно метаболити на амино дихлорфенол, за да допринесе за 3,5-DCA нефротоксичност in vitro.

Доказано е, че N-окислението е важен път на биотрансформация на метаболизма на анилин и хлороанилин, който може да допринесе за хепатотоксичност и потенциално други токсичности, предизвикани от тези съединения [11, 39-41]. N-окисляването на анилин произвежда метаболита фенилхидроксиламин, който допълнително се окислява до метаболита нитрозобензен [39] (Фигура 1). Метаболитите на фенилхидроксиламин и нитрозобензен могат да преминат в редокс цикъл, за да генерират свободни радикали и да окислят двувалентното желязо в хемоглобина и други протеини, съдържащи двувалентно желязо, до тривалентно желязо. Този цикъл превръща хемоглобина в метхемоглобин в еритроцитите, но може също така да повлияе на биологичната активност на други протеини и ензими, които изискват молекула на двувалентно желязо за биологична активност. Метаболитите на нитрозобензен също са реактивни и могат ковалентно да се свързват с нуклеофили на макромолекули в клетка [42,43]. Нитрозогрупата може да бъде допълнително окислена до образуване на нитробензенови метаболити (Фигура 1). Предишни проучвания показват, че 3,5-DCA може да индуцира метхемоглобинемия in vivo и че 3,5-DCPHA (Фигура 1) е основно отговорен за тази токсичност [40,44,45]. Тези открития предполагат, че 3,5-DCPHA се произвежда външно, най-вероятно в черния дроб, и преминава в кръвта, за да предизвика метхемоглобинемия, както се случва с анилина [44,45]. Тези констатации също предполагат, че бъбрекът е изложен на 3,5-DCPHA, произвеждан в извънбъбречни места.

Образуването на 3,5-DCNB от IKC (Таблица 2) показва, че бъбрекът може да образува 3,5-DCPHA от 3,5-DCA. По този начин бъбрекът може да бъде изложен на 3,5-DCPHA както от вътрешно, така и от екстраренално образуване.3,5-DCPHA се оказа най-токсичният тестван метаболит и е вероятно 3,{ {13}}DCPHA има основен принос за 3,{15}}DCA нефротоксичност, директно към бъбречните клетки и/или индиректно чрез хематотоксичност. Също така е вероятно множество ензимни системи да са способни да образуват 35-DCPHA от 3,5-DCA и тези ензимни системи може също да образуват други 3,5-DCA нефротоксични метаболити [46, 47]. Доказано е, че N-окислението на анилинови съединения се катализира от CYPs, флавин монооксигенази (FMOs),

пероксидази и простагландин синтетаза [48-51]. Предишни проучвания от нашата лаборатория показват, че 3,5-DCA нефротоксичността при IKC може да бъде отслабена от инхибитори на тези различни ензимни семейства в различна степен [25], което предполага, че инхибирането на едно ензимно семейство ще позволи 35- DCA да продължи да бъде биоактивиран от други метаболизиращи ензимни системи. За да се определи дали инхибиторите, използвани от Racine et al. [25] променят N-окислението на 3,5-DCA, изследвана е способността на диетилдитиокарбамат (DEDTCA), инхибитор на CYP2C и в по-малка степен CYP2E1, да намалява образуването на DCNB. DEDTCA беше избрана за изследване, защото значително намали цитотоксичността на 3,5-DCA при IKC [25]. Констатацията, че DEDTCA намалява образуването на 3,5-DCNB в IKC подкрепя заключението, че DEDTCA отслабва нефротоксичността на 3,5-DCA, поне отчасти, чрез инхибиране на N-окислението на 3,{{21} }DCA. Тъй като инхибиторът на CYP2E1 изониазид няма ефект върху цитотоксичността на 3,5-DCA, изглежда, че ензимите CYP2C биоактивират 3,5-DCA до токсични метаболити чрез образуване на 3,5-DCPHA.

Цитотоксичността може да бъде получена in vitro в IKC от 3,5-DCPHA чрез два потенциални механизма; редокс цикъл за производство на свободни радикали (напр. супероксиден анионен радикал) и оксидативен стрес или производство на алкилиращ метаболит(и). Racine и др. [25] установяват, че 3,5-DCA-индуцирана цитотоксичност при IKC не се дължи на оксидативен стрес. Намалените и общите нива на глутатион бяха намалени с 3,5-експозиция на DCA, което предполага образуването на реактивен метаболит. В настоящото проучване цитотоксичността на 35-DCPHA е намалена от нуклеофилни антиоксиданти (глутатион и N-ацетил-L-цистеин), но не и от ненуклеофилния антиоксидант аскорбат (Фигура 6). Тези резултати подкрепят един или повече реактивни, алкилиращи метаболити на 3,5-DCPHA като цитотоксични видове.

Хлорираните нитробензени са нефротоксични in vivo и in vitro [34,52,53]. Rickert и Held [3] установиха, че чернодробни микрозоми от мъжки плъхове Fischer 344 метаболизират 3-хлоронитробензен чрез редукция на нитро групата до образуване на 3-хлороанилин, което показва, че метаболизмът между 3,5-DCA и 3,5-DCNB е обратим. По този начин, редукция на 3,5-DCNB ще произведе 3,5-дихлоронитрозобензен и 3,5-DCPHA точно както окисляването на 3,5-DCA произвежда тези два метаболита. Потенциалният принос на 3,5-DCNB към нефротоксичността на 3,5-DCA обаче беше неясен. Ако 35-DCNB е нефротоксичен метаболит, също не е ясно дали е необходима биотрансформация за получаване на токсичните химични видове. Настоящите резултати подкрепят 3,5-DCNB като токсичен3,5-DCA метаболит, потенциално допринасящ за 3,5-DCA нефротоксичност след биотрансформация.

Настоящото проучване показва, че 3,5-DCNB е по-мощен нефротоксичен от 3,5-DCA при IKC [25]. В допълнение, способността на антиоксидантите и инхибиторите на окислителната биотрансформация да намаляват цитотоксичността на 3,5-DCNB отразява ефектите от тези предварителни обработки при намаляване на цитотоксичността на 3,5-DCA при IKC [25]. Тези резултати предполагат, че всеки 3,5-DCNB, образуван по време на биотрансформация на 3,5-DCA, има потенциал да допринесе за нефротоксичността на 3,5-DCA чрез метаболизма на 3,5- DCNB се превръща обратно в 3,5-дихлоронитрзобензен и 3,5-DCPHA. Въпреки това, слабата активност на CYP инхибиторите върху 3,5-DCNB цитотоксичността предполага, че други ензимни системи (напр. не-CYP нитроредуктаза) може да са отговорни за или да допринасят за намаляването на нитро групата в тази моделна система . В допълнение, способността на антиоксидантите значително да намаляват цитотоксичността на 3.5-DCNB подкрепя ролята на свободните радикали, получени от нитрогрупи, и/или реактивни видове кислород/азот в нефротоксичния механизъм за това съединение. Като се има предвид значителното отслабване на нефротоксичността на 3,5-DCNB от някои от инхибиторите на окислителния метаболизъм (напр. n-октиламин и меркаптосукцинат), малко вероятно е 35-DCNB да е директно токсичен за бъбречните клетки, но произвежда неговата цитотоксичност чрез метаболити. В допълнение, in vitro проучванията на метаболизма на 3,5-DCA предполагат, че бъбречните клетки може да не произвеждат достатъчно 3,5-DCNB, за да бъдат отговорни за цитотоксичността на 3,5-DCA in vitro. Възможно е извънбъбречният метаболизъм на 3,5-DCA да произвежда достатъчно 3,5-DCNB, за да допринесе за индуцирана от 3,5-DCA нефротоксичност in vivo, но общият принос на 3,{{ 46}}DCNB до 3,5-DCA нефротоксичността ще изисква допълнително проучване.

В обобщение, резултатите от тези проучвания показват, че външно генерираните метаболити на амино-одихлорфенол и метаболитите, произтичащи от N-окисление, имат потенциала да допринесат за 3.5-DCA нефротоксичност in vivo, докато N-ацетилирането на {{5} }DCA е механизъм за детоксикация. In vitro, N-окислението на 3,5-DCA е основният механизъм на биоактивиране на 3,5-DCA до цитотоксични метаболити, а токсичността най-вероятно се медиира от 3,5-дихлоронитрзобензен и /или 3,5-DCPHA. В допълнение, 3,5-DCNB-индуцираната нефротоксичност се дължи на образуването на метаболити, а нефротоксичността на 3,5-DCNB също най-вероятно е медиирана с 3,5-дихлоронитрзобензен и/или 35-DCPHA.

4. Материали и методи

4.1.Животни

Мъжки плъхове Fischer 344 (200-250 g) са получени от Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, USA). Животните са настанили по два плъха в клетка с храна и вода ad libitum, с контролирана температура (21-23 градуса), влажност (40-55 процента) и светлина (12 часа включено/12 часа изключено). Преди употреба всички животни бяха оставени най-малко една седмица да се аклиматизират в акредитирани съоръжения за животни на Американската асоциация за акредитация на грижите за лабораторни животни (AAALAC). Всяко използване на животни е одобрено от Комитета за институционална грижа и използване на животните на университета Маршал (протоколи 447 (5 август 2010 г.) и 531 (1 февруари 2013 г.)), а експериментите с използване на животни са проведени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни , приети от Националния здравен институт.

4.2. Химикали

Всички химикали са закупени с най-висока налична чистота от Fischer Scientific (Питсбърг, Пенсилвания, САЩ) или Sigma Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), с изключение на 3,5-дихлорофенилхидроксиламин (3,{{3} }DCPHA), 35-дихлороацетанилид (3.5-DCAA) и 2-амино-4,6-дихлорофенол(2-A{{11 }},6-DCP), които бяха синтезирани в нашата лаборатория. 3,5-DCPHA се синтезира чрез редукция на 3,5-DCNB, като се използва хидразин-паладий върху въглерод чрез описания по-рано метод на Rondestvedt и Johnson [54] и се пречиства, както е описано от Valentovic et al. [55]. Синтезът и пречистването на 3,5-DCAA са извършени с помощта на метода на Newell et al. [56] чрез взаимодействие на равни количества от 3,5-дихлороанилин и оцетен анхидрид в присъствието на натриев ацетат. За да се получи 2-A-4,6-DCP, 2,4-дихлорфенолът се нитрира по метода на McMillan et al [29,57], последвано от редукция на нитро група до амино група с натриев хидросулфит в 10 процента воден разтвор на натриев хидроксид съгласно Newell et al. [56].

4.3. Подготовка и обработка на изолирани бъбречни клетки

Изолирани бъбречни клетки(IKC) са получени от нетретирани мъжки плъхове Fischer 344. Мъжки плъхове Fischer 344 бяха избрани като модел за получаване на изолирани бъбречни клетки, тъй като повечето от нашите предишни данни за токсичност с 3,5-DCA са получени в този модел. Плъховете се анестезират с пентобарбитал (75 mg/kg, ip) и IKC се приготвя по метода на Jones et al [58]. използвайки колагеназна перфузия, както е описано от Racine et al. [25]. Бъбречните клетки, изолирани чрез тази техника, са обогатени с бъбречни кортикални клетки въз основа на биохимична характеристика и често се използват при оценки на бъбречната токсикология [59-63]. Първоначалната клетъчна жизнеспособност беше определена на ~85-90 процента чрез освобождаване на лактат дехидрогеназа (LDH) и изключване на трипаново синьо (2 процента w/o). Преди инкубацията, IKC бяха преброени и ресуспендирани в буфер на Krebs-Henseleit (рН 7,37; 25 mM Hepes; 2 процента w/o говежди серумен албумин) при концентрация от ~4,2 милиона клетки/mL. IKC (3 mL) бяха предварително инкубирани в 25 mL поликарбонатни ерленмайерови колби за 5 минути при 37 градуса в атмосфера от 95 процента кислород/5 процента въглероден диоксид. След предварителната инкубация клетките бяха изложени на различни концентрации от 3,5-DCNB (0.5-1.5 mM), 3.5-DCAA({{32} }.5-1.5 mM),3.5-дихлорофенилхидроксиламин (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4,6-DCP （0.5-1.5 mM） или носител （30 μL DMSO） за до 90 мин. В края на определения инкубационен период бяха взети проби (0,5 mL) за анализ на освобождаването на LDH, както е описано по-горе [20,25].

За определяне на ролята набъбречна биотрансформацияпри 3,5-DCNB цитотоксичност и свободни радикали при35-DCPHA нефротоксичност, IKC бяха предварително третирани или с антиоксидант, или с инхибитор на ензимни системи за биотрансформация (Таблица 4) или с носител (30uL DMSO) преди излагане на 1.0mM35-DCNB (60 минути) или 0,5 mM3,5-DCPHA (60 минути). Всички концентрации и времена на предварителна обработка наантиоксидантииинхибитори на бъбречните ензимиса базирани на предишни публикувани проучвания [20,25].

4.4.IKC Метаболизъм на 3,5-DCA

4.4.1. IKC инкубации и изолиране на метаболит

IKC (~4,2 милиона клетки/mL; 3 mL) се инкубират с 3,5-DCA(0.5 или 1.0mM) в буфер на Krebs-Henseleit (KH) ( рН 7,4) за 9 0 минути в разклащаща се водна баня под атмосфера от 95 процента кислород/5 процента въглероден диоксид, както е описано по-горе. 0.5 mM концентрация на 3,5-DCA е нецитотоксична концентрация при 90 min, докато концентрацията от 1.0 mM индуцира цитотоксичност, както се вижда от повишено освобождаване на LDH. В края на инкубационния период бяха събрани проби от 1.0 mL и средата и клетките бяха разделени чрез центрофугиране. Пелетираните клетки се промиват с KH буфер (без говежди серумен албумин) и промивката се добавя към средата. Клетките се лизират чрез ултразвук и протеинът се утаява чрез добавяне на метанол (1.0 mL) към всички проби. Пробите се центрофугират (3000 g; 10 минути 4 градуса ） и супернатантата се филтрува през 0,45 μ филтър за спринцовка и се съхранява при -20 градуса, докато се анализира чрез HPLC, както е описано по-долу.

4.4.2. Определяне на сулфатни и глюкуронидни конюгати

За да се определи дали са образувани сулфатни или глюкуронидни конюгати, в някои експерименти средата и фракциите от клетъчния супернатант, получени, както е описано по-горе, се третират с ß-глюкуронидаза (6500 единици/mL, крайна концентрация) или арилсулфатаза (200 единици/mL, крайна концентрация) плюс сакахаролактон (20 mM, крайна концентрация) за 18 часа (37 градуса) в 0,1 М ацетатен буфер (рН 5,0), за да се хидролизират всички глюкуронидни или сулфатни конюгати, съответно, които са се образували 26] . Хидролизата се спира чрез добавяне на студен метанол (2.4 mL). След това фракциите се филтрират и съхраняват до анализиране, както е описано по-горе.

4.4.3. Инхибиране на CYP2C метаболизма от DEDCTA

В отделен експеримент клетките бяха предварително третирани с диетилдитиокарбаматна киселина (DEDTCA, 0.1 mM, 30 минути предварителна обработка), инхибитор на CYP2C, преди добавянето на 3,5-DCA, за да се определи кои метаболити са намалени с DEDTCA предварителна обработка. След 90 минути инкубационен период, клетките и средата бяха третирани и съхранени, както е описано по-горе, за определяне на концентрациите на 3,5-DCA и концентрациите на образуваните 3,5-DCA метаболити.

4.4.4. HPLC определяне на метаболити

Проби (75 µL) от среда и лизирани IKC бяха анализирани на Waters Alliance e2695 HPLC система (Waters Co., Milford, MA, USA), като се използва Waters 2489 променлив UV/Vis детектор при 254 nM. Хроматограмите бяха събрани и интегрирани с помощта на софтуера Empower 3 (Waters Co., Milford, MA, USA）. Колона Waters X Select HSS T3 C18 （3,5 μm; 4,6 × 150 mm²), оборудвана с Waters XSelect HSS T3 VanGuard Cartridge (3.5 um;3.9×5mm2) се използва за разделяне на съединения. Подвижната фаза се състои от 50:50 метанол; вода със скорост на потока 0.75 mL/min. Стандартни криви , границите на откриване и коефициентите на екстракция бяха определени за 3,5-DCA и предполагаеми метаболити. Коефициентите на екстракция бяха определени чрез сравняване на интегрирането на 1,0 mM3,5-DCA или метаболитна проба, която е била подложена на проба обработка (т.е. добавяне на метанол и центрофугиране) към тази на непреработена 1.0 mM 35-DCA или метаболитна проба.

4.5. Статистика

Данните са представени като средно ± SEM с N от {{0}} отделни експерименти с животни, с изключение на N=3 в нетоксичния 0,5 mM 3,5-DCA метаболичен експеримент. Данните между леченията бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от тест на Tukey. Значението беше определено на стр<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Авторски принос: CRR: преглед на литературата, провеждане на работата, анализ на данни и интерпретация, допринесли за написването на статията; MAV: експериментален дизайн и интерпретация на данни, DKA: подпомагане на работата и подготовката на доклада; GOR: преглед на литературата, експериментален дизайн, интерпретация на данни, написа и редактира статията. Всички автори са прочели и са съгласни с публикуваната версия на ръкописа.

Финансиране: Това изследване е подкрепено отчасти от Националния институт по общи медицински науки на Националния институт по здравеопазване под номер на награда P20GM103434 към GOR Съдържанието е отговорност единствено на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на Националния институт по здравеопазване. .

Изявление на институционалния съвет за преглед: Цялата употреба на животни е одобрена от Комитета за институционална грижа и използване на животните към Университета Маршал (протоколи 447 (5 август 2010 г.) и 531 (1 февруари 2013 г.)), а експериментите с употребата на животни са проведени в съответствие с Ръководството за грижа и употреба на Лабораторни животни, приети от Националния институт по здравеопазване.

Декларация за наличност на данни: Данните, представени в това проучване, са достъпни при поискване от съответния автор.

Конфликт на интереси: Авторите декларират липса на конфликт на интереси.

Препратки

1. Aizawa, H. Метаболитни карти на пестицидите; Academic Press, Inc.: Лондон, Великобритания, 1989 г.; Том 2.

2. Ehlhardt, WJ Метаболизъм и разположение на противораковото средство сяра при мишка, плъх, маймуна и човек. Лекарство Metab. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]

3. Rickert, DD; Held, SD Метаболизъм на хлоронитробензени от изолирани хепатоцити на плъх. Лекарство Metab. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]

4. Лий, JB; Sohn, HY; Шин, KS; Ким, JS; Джо, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Ким, JE; Kwon, GS Микробно биоразграждане и токсичност на винклозолин и неговия токсичен метаболит 3,5-дихлороанилин. J. Microbiol. Биотехнология. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Сантос, TCR; Rocha, JC; Алонса, RM; Мартинез, Е.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Бързо разграждане на пропанил в оризови култури. Environ. Sci. техн. 1998, 32, 3479–3484. [CrossRef]

6. Марлет, VL; Martyniuk, CJ Биологични отговори на фенилкарбамидни хербициди при риби и земноводни; нови насоки за характеризиране на механизмите на токсичност. Comp. Biochem. Physiol. C Токсикол. Pharmacol. 2017, 194, 9–21. [CrossRef]

7. Линд, CH; Littorin, М.; Амилон, А.; Jonsson, BA Анализ на 3,5-дихлороанилин като биомаркер на винклозолин и ипродион в човешка урина с помощта на течна хроматография/тройна квадруполна масспектрометрия. Бърза Комун. Масов спектър. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Кутинг, Б.; Гоен, Т.; Швеглер, У.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarylamines в общата популация - Напречно проучване, базирано на населението, включващо 1004 баварски субекта. Вътр. J. Hyg. Environ. Здраве 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Турчи, Р.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Определяне на дихлоранилини в човешка урина чрез газова хроматография/масспектрометрия: Протокол за валидиране и установяване на референтни стойности в популационна група, живееща в Централна Италия. Бърза Комун. Масов спектър. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Вители, Н.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Сомаруга, С.; Turci, R.; Minoia, C.; Брамбила, Г.; Colombi, A. Професионална и екологична експозиция на анилидни и дикарбоксимидни пестициди. G. Ital. Med. Лав. Ергон. 2007, 29 (Допълнение 3), 276–277.

11. Chhabra, RS; Томпсън, М.; Elwell, MR; Gerken, DK Токсичност на р-хлороанилин при плъхове и мишки. Food Chem. Токсикол. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]

12. Гилермино, Л.; Soares, AM; Карвальо, AP; Lopes, MC Остри ефекти на 3,4-дихлороанилин върху кръвта на мъжки плъхове Wistar. Chemosphere 1998, 37, 619–632. [CrossRef]

13. Пизон, А.Ф.; Шварц, AR; Шум, LM; Rittenberger, JC; Долен, DR; Giannoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Токсикологичен лабораторен анализ и излагане на хора на p-хлороанилин. Clin. Токсикол. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Кьониг, CM; Beevers, C.; Пант, К.; Young, RR Оценка на мутагенния потенциал на пара-хлороанилин и анилин в черния дроб, далака и костния мозък на Big Blue® плъхове с анализ на микроядра в периферна кръв. Environ. Mol. Мутаген. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovic, MA; Бол, JG; Anestis, DK; Бира, KW; Мадан, Е.; Hubbard, JL; Rankin, GO Остра бъбречна и чернодробна токсичност на 2-халоанилини при плъхове Fischer 344. Токсикология 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovic, MA; Бол, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Сравнение на in vitro токсичността на структурни изомери на дихлороанилин. Токсикол. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovic, MA; Lo, HH; Браун, PI; Ранкин, GO 3, 5-Токсичност на дихлороанилин при плъхове Fischer 344, третирани предварително с инхибитори и индуктори на цитохром Р450. Токсикол. Лет. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]

18. Bhuiyan, MNH; Канг, Х.; Ким, JH; Ким, С.; Kho, Y.; Choi, K. Ендокринно разрушаване от няколко анилинови производни и свързани механизми в човешка надбъбречна H295R клетъчна линия и възрастни мъжки риби зебра. Екотоксикол. Environ. Саф. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]

19. Хонг, SK; Anestis, DK; Хендерсън, TT; Rankin, GO Халоанилин-индуцирана in vitro нефротоксичност: Ефекти на 4-халоанилини и 3,5-дихалоанилини. Токсикол. Лет. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Racine, C.; Уорд, Д.; Anestis, DK; Фъргюсън, Т.; Престън, Д.; Rankin, GO 3,4,5-Нефротоксичност на трихлороанилин in vitro: Потенциална роля на свободните радикали и бъбречна биотрансформация. Вътр. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Кратък международен документ за химическа оценка 48—4-хлоранилин; Световна здравна организация: Женева, Швейцария, 2003 г.

22. Vangnai, AS; Катаока, Н.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Таджима, Т.; Kato, J. Конструиране и приложение на биорепортер на Escherichia coli за откриване на анилин и хлороанилин. J. Ind. Microbiol. Биотехнология. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; Браун, PI; Rankin, GO Остра нефротоксичност, индуцирана от изомерни дихлоранилини при плъхове Fischer 344. Токсикология 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Ранкин, GO; Янг, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Браун, PI 3, 5-Дихлороанилин-индуцирана нефротоксичност при плъх Sprague-Dawley. Токсикол. Лет. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Расин, CR; Фъргюсън, Т.; Престън, Д.; Уорд, Д.; Бол, Дж.; Anestis, D.; Валентович, М.; Rankin, GO. Ролята на биотрансформацията и оксидативния стрес при нефротоксичност, индуцирана от 3,5-дихлороанилин (3,5-DCA) в изолирани бъбречни кортикални клетки от мъжки плъхове Fischer 344. Токсикология 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Хонг, SK; Rankin, GO Биотрансформация на 2-хлороанилин в плъх Fischer 344: Идентифициране на метаболити в урината. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]

27. Ранкин, GO; Racine, C.; Суини, А.; Крайние, А.; Anestis, DK; Barnett, JB In vitro нефротоксичност, индуцирана от пропанил. Environ. Токсикол. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]