Част 2 Химическа и генетична дискриминация на Cistanches Herba въз основа на UPLC-QTOF/MS и ДНК баркодиране

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

OPLS-DA и идентификация на маркера За идентифициране на потенциални химични маркери за разграничаване на двата вида беше генериран S-график на OPLS-DA (фиг. 3). В S-графиката всяка точка представлява една йонна двойка tR–m/z. Осите X и Y представляват съответно приноса и увереността на йона; колкото по-далече е разстоянието, което йонната двойка tR–m/z сочи от нулата, толкова по-голям е приносът/увереността на тази икона към разликата между двете групи. По този начин йонът tR–m/z, сочещ към двата края на „S“, представлява характерните маркери с най-голяма увереност във всяка група. Резултатите от OPLS-DA показват, че UPLC-QTOF/MS може да се използва за разграничаванеЦистанче deserticolaотCistanche tubulosa(фиг. 3). Бяха определени общо шест достоверни и значими маркера за улесняване на дискриминацията на тези групи (Таблица 3). Идентичностите на три потенциални маркера бяха условно определени. Компонентите, свързани с тези три йона, бяха условно идентифицирани като изомери на кампнеозид II, цистанозид С и цистанозид А. Маркерните съединения a, b и c могат да се използват за разграничаване на двата растителни вида, тъй като йонните интензитети на a и b вЦистанче deserticolaбеше по-висока, отколкото вCistanche tubulosa(Фиг. 4A, 4B) и маркер c може да бъде открит вCistanche tubulosa, но не и вЦистанче deserticola(Фиг. 4C).

ДНК баркодиране: информация за последователността и ефективност на идентификацията

Информацията за последователността е показана в таблица 4. Средното генетично разстояние на psbA-trnH (0.1732) е по-голямо от другите два региона (0.0740 , 0,1197) значително. Средното GC съдържание на psbA-trnH (20,64 процента) е по-малко от другите два региона (55.00 процента, 55.00 процента). Въпреки че степента на успеваемост на ITS и ITS2 не беше получена в това проучване, psbA-trnH областта се представи добре при PCR амплификация и секвениране (100 процента, 87,23 процента). Ефективността на идентификацията беше постигната чрез анализ BLAST1 и метода на най-близкото разстояние и отразяваше главно степента на успех на баркодовете. Регионът psbA-trnH беше очевидно по-висок от другите два баркода по ефективност на идентификация въз основа на два метода. Недостигът на последователности най-вероятно е причината ITS регионът да показва 100% ефективност на идентификация въз основа на метода BLAST1 и 0 въз основа на метода на най-близкото разстояние.

Анализ на генетичната дивергенция с помощта на шест параметъра

Бяха използвани шест параметъра за анализиране на вътрешноспецифична вариация и междуспецифична дивергенция с помощта на три баркода (Таблица 5). Значителната разлика между между- и вътрешноспецифичните вариации е показателна за полезността на ДНК баркодовете. Тук минималното междувидово разстояние от три баркода беше по-високо от максималното вътрешновидово разстояние. Нещо повече, регионът psbA-trnH има по-голямо максимално вътрешноспецифично разстояние и средно междувидово разстояние от другите два баркода, което показва, че регионът psbA-trnH се представя добре при разграничаване на два произхода на Cistanches Herba.

Анализ на пропуските в баркодирането за идентифициране

Цистанче deserticolaиЦистанче tubulosaРазликата в баркодирането представя забележителната вариация на междувидовите и вътрешновидовите проби и демонстрира отделни, неприпокриващи се разпределения между вътрешно- и междувидовите проби. В това проучване (Фиг. 5) диапазонът на разстоянието беше зададен на 0–0.45, тъй като най-голямото K2P разстояние на psbA-trnH междуЦистанче deserticolaиЦистанче tubulosaбеше близо до 0.45. Трите баркода показаха различни пропуски в разпределението на вътрешно- и междувидовите вариации. Освен това празнината на psbA-trnH беше значително по-голяма от другите два баркода. Следователно регионът psbA-trnH може да бъде идеален баркод за разграничаване на два произхода нацистанчииHerba.

Дърво за свързване на съседи (NJ).

NJ дърво илюстрира връзката между видовете и улеснява определянето на тяхното групиране. В това проучване дървото на NJ от три баркода е изградено въз основа на K2P модел (фиг. 6). Резултатите показват, че два произхода на Cistanches Herba са групирани в два клада поотделно. По този начин дървото NJ ясно разграничаваЦистанче deserticolaиЦистанче tubulosa.

Дискусия и заключения

Cistanches Herba е важен лекарствен материал, който обикновено се използва за хранене на азиатската общност [38]. Въпреки това двата произхода нацистанчииHerba, Цистанче deserticolaиЦистанче tubulosa, имат различен химичен състав и съответно фармакологична активност. Едновременно с това двата произхода се различават по отношение на клиничното приложение и пазара на стоки. Класификацията на Cistanche е объркана и масивни заместители и подправки наводняват пазара поради недостига на ресурси и специална среда за отглеждане на Cistanches Herba. Приема се, че родът Cistanche включва четири вида и един вариант:Цистанче deserticola, Цистанче tubulosa, Цистанче sinensis, Цистанче салса, иЦистанчесалсавар. албифлора [39]. Изследователи в Япония считат произхода нацистанчииHerba asЦистанче салса[40–43], докато беше идентифициран катоЦистанче deserticolaот Ту [44–46]. Поради това е объркан в класификацията на Cistanches и е трудно да се разграничат двата произхода на Cistanches Herba. Традиционните методи за контрол на качеството на Cistanches Herba са морфологична идентификация [47,48], микроскопска идентификация [49] и TLC (тънкослойна хроматография) [50,51], FTIR (инфрачервена спектроскопия с преобразуване на Фурие) [14], HPLC (висока Ефективна течна хроматография) [52,53]. Морфологичният и микроскопският метод могат лесно да диференцират видове от различни родове или семейства, които притежават големи разлики в морфологични и микроскопични характеристики, докато е трудно да се разграничат видовете братя. TLC и FTIR могат ясно да разграничат видове, които притежават различни видове химически състави, докато е трудно да се определи химическият компонент и съдържанието. HPLC се използва главно за диференциране на видове с различно съдържание на химични елементи, въпреки това времето за анализ е по-дълго и чувствителността е относително по-ниска в сравнение с UPLC. Съответно технологията UPLC-QTOF/MS беше по-бърза и по-точна при определяне на химичния състав от други химични методи. Методите за молекулярна идентификация се показват добре при разграничаване въз основа на генетичната вариация, като SDS-PAGE (електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел) [54], AFLP (полиморфизъм на дължината на усилен фрагмент) [55,56]. Тези молекулярни методи обаче не са лесни за работа и не са универсални. Съответно, ДНК баркодирането може да разграничава видовете по-универсално, бързо и точно от други молекулярни методи. За видовете от същия род и тясна генетична връзка тези методи сами по себе си може да не се представят добре при идентификация.

Тук комбинирахме UPLC-QTOF/MS и ДНК баркодиране при идентифициранеЦистанче deserticolaиЦистанче tubulosaи оцени химическите и молекулярните маркери, които биха позволили да бъдат дискриминирани. Бяха открити 23 квалифицирани масови пика и 16 бяха идентифицирани чрез използване на UPLC–QTOF/MS и първо бяха открити три потенциални маркерни съединения, които улесняват разграничаването на два произхода чрез PCA и OPLS-DA анализ. Освен това, четири индикатора бяха оценени чрез технологията за баркодиране на ДНК по отношение на способността им да разграничават два произхода: ефективност на идентификацията, генетична ефективност, пропуск в баркодиране и анализ на NJ дърво. Регионът psbA-trnH се поддържа като подходящ ДНК баркод за разграничаванеЦистанче deserticolaиЦистанче tubulosa. В заключение, ние първо създадохме нов комбиниран метод за молекулярен и химичен анализ за разграничаване и контрол на качеството в два произхода на Cistanches Herba. ДНК баркодът може да разграничи два произхода на генетичните вариации и да удостовери видовете универсално и точно; Технологията UPLC-QTOF/MS може да анализира химичния състав, за да оцени бързо и точно качеството на медицинските материали. Комбинираният метод на ДНК баркодиране и технологията UPLC-QTOF/MS гарантира по-точна и научна идентификация в множество източници на медицински материали и може да служи като метод за идентифициране на други объркващи видове или родове в класификацията.

Авторски принос

Концепция и дизайн на експериментите: LFH SHZ LBW. Проведе експериментите: SHZ LBW. Анализирани са данните: SHZ LBW. Допринесени реактиви/материали/инструменти за анализ: LFH. Написа статията: SHZ XJ LBW. Проверете ръкописа: ZHW.

Cistanche deserticola има много ефекти, щракнете тук, за да научите повече

Препратки

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY и др. (1996) Сравнение на подхранването на бъбреците и ян укрепването на ефикасността на три различни видабилкацистанчета. Вестник на китайските медицински материали 19: 420–421.

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Сравнение на функциите за подхранване на бъбреците и укрепване на Ян на три различни видабилкацистанчета. Китайски вестник на китайската Materia Medica 19: 169–171.

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Напредък в изследванията на химическите съставки в растенията наЦистанчеПъшкане. и връзка. Китайски традиционни и билкови лекарства 34: 473–476.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Фенилетаноидни аминогликозиди и ацилирани олигозахари с вазорелаксираща активност отЦистанчеtubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475.

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ и др. (2009) Хипохолестеролемичните ефекти наЦистанчеtubulosaекстракт, китайско традиционно сурово лекарство, при мишки. Am J Chin Med 37: 1125–1138.

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Инхибиторен ефект на актеозид, изолиран отЦистанчеtubulosaвърху освобождаването на химически медиатор и производството на възпалителни цитокини от RBL-2H3 и KU812 клетки. Planta Med, 1512–1518.

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Ацилирани фенилетаноидни аминогликозиди с хепатопротективна активност от пустинно растениеЦистанчеtubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890.

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Иридоидни и ациклични монотерпенови гликозиди, канканозиди L, M, N, O и P отЦистанчеtubulosa. Chem Pharm Bull (Токио) 58: 1403–1407.

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Идентифициране и проучване на търговски суров наркотик от herba cistanche. Вестник на китайските медицински материали 20: 117– 122.

10. Zhu SY (2001) Фармакогностична идентификация наЦистанчеtubulosaобъркан вид наЦистанчеdeserticola. Вестник на китайските медицински материали 24: 24–25.

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG и др. (2013) Микроскопска идентификация на трибилкацистанчетав Син Дзян. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Микроскопска идентификация на търговскиHerbaцистанчиичрез техника за цифрово изобразяване. Вестник на китайските медицински материали 27: 400–402.

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Проучване върху идентифицирането набилкацистанчетаи прелюбодейци. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN и др. (2010) FTIR и 2D-IR спектроскопски изследвания на различни източници набилкацистанчета. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J и др. (2009) Идентификация наЦистанчеdeserticolaот солариум Boschniakla rossica и Cynomorium с помощта на FTIR и двумерна корелационна IR спектроскопия. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Проучване на пръстови отпечатъци HPLC наЦистанчеdeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Хроматографски пръстов отпечатък наЦистанчеdeserticolaчрез HPLC. Китайски традиционни и билкови лекарства 36: 268–271.

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J и др. (2010) Идентификация наЦистанчевидове (Orobanchaceae) на базата на последователности на междугенния регион на пластида psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Идентификация наЦистанчеВидове по химически и междупрости последователности, повтарящи се пръстови отпечатъци. Biol. Pharm. Bull., 32: 142–146.

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W и др. (2012) Структурна характеристика и идентификация на фенилетаноидни гликозиди отцистанчииdeserticolaYC Мачрез UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Фитохимичен анализ 23: 668–676.

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS анализ на алкалоиди в традиционно обработен Coptis chinensis Franch. Базирано на доказателства допълнение Alternat Med 2012: 942384.

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Изследване на технологията за обработка на листа от мушмула (Eriobotrya japonica) чрез ултра-ефективна течна хроматография - квадруполна времепролетна масспектрометрия, комбинирана с хемометрия. PLoS ONE 8: e64178.

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Баркодиране на животински живот: цитохром c оксидаза субединица 1 различия сред тясно свързани видове. Proc. R. Soc. Лонд. Б., 270 Допълнение 1: S96–99.

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Биологични идентификации чрез ДНК баркодове. Proc Biol Sci., 270: 313:321.

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Използване на ДНК баркодове за идентифициране на цъфтящи растения. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369–8374.

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Валидиране на региона ITS2 като нов ДНК баркод за идентифициране на видове лечебни растения. PLoS One 5: e8613.

27. Тамура K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Молекулярен еволюционен генетичен анализ с използване на методи на максимална вероятност, еволюционно разстояние и максимална пестеливост. Mol Biol Evol 28: 2731–2739.

28. Meyer CP, Paulay G (2005) ДНК баркодиране: нива на грешки въз основа на цялостно вземане на проби. PLoS Biol 3: e422.

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Изследвания върху съставните частиЦистанчеHerba.IV. Изолиране и структури на два нови фенилпропаноидни гликозида, цистанозиди C и D. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885.

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Изследвания върху съставките наЦистанчеHerba. VI. Изолиране и структури на нов иридоиден гликозид, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650.

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Диференциация наHerbaцистанчиичрез пръстов отпечатък с високоефективна течна хроматография–откриване на диодна матрица–масспектрометрия. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162.

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Структурна характеристика и идентификация на фенилетаноидни гликозиди отCistanches deserticola YC Maчрез UHPLC/ESI–QTOF–MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676.

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC и др. (2008) Изолиране и пречистване на фенилетаноидни гликозиди отЦистанчеdeserticolaчрез високоскоростна противотокова хроматография. Хранителна химия 108: 702–710.

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S и др. (2013) Количествен анализ нацистанчииHerbaизползвайки високоефективна течна хроматография, съчетана с откриване на диодна матрица и масова спектрометрия с висока разделителна способност, комбинирана с хемометрични методи. J Sep Sci 26: 1945–1952.

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Изследвания на съставкитеЦистанчеHerba. V. Изолиране и структури на два нови фенилпропаноидни гликозида, цистанозид Е и F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457.

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Анализ на химичните съставки вЦистанчевидове. J Chromatogr A 1216:1970–1979.

37. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Обработка на данни в науката и технологиите. Хемометрия: учебник.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Екотипове наCistanche deserticolaвъз основа на химически компонент и молекулни характеристики. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) изследване и индустриално развитие на herbaцистанчета. Journal of Chinese pharmaceutical 46: 882–887.

40. Кобаяши Х, Огучи Х, Такизава, Миясе Т, Уено А ​​и др. (1987) Нови фенилетаноидни гликозиди отЦистанчеtubulosa(SCHRENK) Кука. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314.