Част 3: Канабиноидният рецептор тип 2 насърчава бъбречната фиброза чрез оркестриране на B-катенин сигнализация

Контакт: emily.li@wecistanche.com

Цистанче е полезно за бъбреците

Рядко обаче се съобщава, че има връзка между CB2 и -catenin.

CB2 е член на семейството GPCR. По-рано установихме, че CB2 се експресира в тубулни клетки, фибробласти и макрофаги. CB2 също се експресира в подоцити и мезангиални клетки.3 Ролята на CB2 при ХБН беше противоречива в миналото. Въпреки повишената регулация на CB2 иРНК и неговия основен ендогенен лиганд 2-AG в модели на ХБН, по-рано беше съобщено, че CB2 агонист може да подобри бъбречната фиброза. За разлика от това, нашите предишни проучвания идентифицираха вредна роля на CB2 при бъбречна фиброза чрез експерименти с генетичен нокаут и анализи с по-селективния CB2 обратен агонист XL-001, нов CB2 обратен агонист, който проявява най-силен афинитет на свързване към CB2 рецептора, с най-добра селективност спрямо CB1 re-рецептора (2594- пъти) и Ki от 0.5 nM. Трябва да се отбележи, че -катенинът и неговите мишени се потискат чрез генетична аблация или фармакологично инхибиране на CB2. Като се има предвид, че CB2 е член на семейството на GPCR, CB2 може да модулира -катенин. Тази хипотеза обаче трябва да бъде потвърдена. В това проучване ние показахме, че CB2 медиира активирането на -катенин чрез GPCR сигнална вълна.

Нашето проучване също потвърждава нововъзникващата роля на ендоканабиноидната система при бъбречна фиброза. От двата основни ендо-канабиноида, анандамидът (N-арахидоноилетаноламин) има по-висок афинитет към CBl, докато 2-AG има подобен афинитет към CB1 и CB2 (неговият афинитет към CB1 е малко по-висок). Следователно, {{ 7}}AG е основният ендоканабиноиден агонист за CB2 рецептора. По-специално, набъбрекмозъчната кора показва подобни високи базални нива на анандамид и2-AG; но нивата на 2-AG са повишени повече при обструктивнафиброзананабъбрек, придружено от намаляване на нивата на анандамид, което води до активиране както на CB2, така и на CB1. Трябва да се отбележи, че пагубната роля на CB2 в патогенезата набъбречнафиброзабеше демонстрирано чрез генетични подходи в нашето скорошно проучване,'' и е допълнително потвърдено в настоящото изследване.

Въпреки че предишен доклад показа, че CB2 се експресира както от възпалителни клетки, така и от подоцити на високо базално ниво,8 CB2 и неговият основен ендогенен лиганд 2-AG всъщност се регулират нагоре след UUO и IRI.7По-специално, при бъбречна фиброза на мишки и разнообразие от човешки нефропатии, CB2 се експресира предимно в бъбречния тубуларен епител, както и в интерстициални фибробласти и левкоцити (Фигура 2; Допълнителна фигура S1), което предполага, че повишената регулация на CB2 е често срещана патологична характеристика във фиброзните бъбреци. В нашите проучвания върху животни ние приехме флуоресцентна in situ хибридизация на CB2, за да идентифицираме неговия модел на експресия поради ниската му цена. Оцветяването разкри, че CB2 се експресира главно в тубуларен епител. Причината за това несъответствие може да се крие в чувствителността на техниката на флуоресцентна in situ хибридизация при откриването на силно изобилни иРНК и времето на експозиция за изображения. Наблюдавахме СВ2 не само в клетъчната мембрана, но и в тубулната цитоплазмена област, което предполага интернализация на рецептора във вътреклетъчни компартменти, като ендозоми и лизозоми. Специфичността на флуоресцентния in situ хибридизиращ анализ беше потвърдена с първично СВ2 антитяло и двете бяха проверени в CB2 нокаут мишки (допълнителна фигура S1). Интересно е, че наблюдавахме хетеродимерно образуване на CB2 с ​​CB1 в засегнати от UUOбъбреции тубулни клетки- -, предизвикани от трансформиращ растежен фактор (допълнителна фигура S4), което предполага, че техните стимулиращи ефекти може да са синергични. Експресията на CB1 обаче не е повлияна от AM1241 или XL-001, което добавя допълнителна сложност към механизмите. Както беше споменато по-рано по отношение на взаимно инхибиращите ефекти на CB2 и CB1, трябва да се извършат повече проучвания, за да се проверят техните взаимосвързани ефекти, изследване извън обхвата на настоящото проучване. Въпреки това, нашите предишни и настоящи констатации последователно разкриват, че блокадата на CB2 е потенциална терапевтична интервенционна стратегия за предотвратяване на бъбречна фиброза. Наред с информирането на пациентите с ХБН, нашите констатации предоставят здравни предупреждения за бързо разрастващата се група.

Фигура 10| Канабиноидният рецептор тип 2 (CB2) е мишена надолу по веригата на -catenin ( -cat). (a) Биоинформатичният анализ разкрива наличието на предполагаеми сайтове за свързване на Т-клетъчен фактор (TCF) (TBSs) в промоторната област на човешки и миши CB2 гени. Последователностите и позициите на предполагаемите TBS в CB2 гените са подчертани (червено), докато консенсусната последователност на TBS е дадена в долната част на този панел. (b) Представителни резултати от анализ на имунопреципитация на хроматин (ChlP), показващи свързването на TCF или лимфоиден усилвател-свързващ фактор (LEF) -1 към промоторната област на CB2 гена. Човекбъбрекпроксималните тубуларни (HKC)-8 клетки бяха трансфектирани с -катенин експресионен плазмид (pFlag- -cat) или pcDNA3 за 24 часа. Клетъчните усати се утаяват с антитяло срещу TCF, LEF-1, хистон H3 или неимунен lgG и анализът на чипа се извършва за CB2 генни промотори. Общият разреден лизат се използва като обща геномна входна ДНК. (c) Графично представяне на нивото на CB2 mRNA. HKC-8 клетки бяха трансфектирани с pFlag- -cat или pcDNA3 плазмид. Общата РНК се анализира чрез количествена полимеразна верижна реакция.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">на потребители на ендоканабиноиди, както за развлекателни, така и за медицински цели. Хроничната интензивна употреба може да доведе до непрекъснато активиране както на CB1, така и на CB2 рецепторите, което може да има отрицателни ефекти върхубъбрекздраве.

Въпреки че предишен доклад показа, че -арестин 1 играе роля в бъбречната фиброза и активирането на -катенин, ние допълнително изясняваме подробно функционалните механизми на медиирания от -арестин 1-CB2/-катенин път. Открихме -арестин 1 е по-изобилен от -арестин 2 при IRI мишки (данните не са показани).Добре известно е, че -арестин 1 е отговорен за активирането на GPCR и сигналната трансдукция надолу по веригата чрез Src, AKT, извънклетъчна сигнално-регулирана протеин киназа (ERK1/2) и други кинази.2че активирането на Src може да медиира няколко профиброзни пътища, като рецептор на епидермален растежен фактор и сигнален преобразувател и активатор на транскрипция (STAT)3," не можем да изключим възможността, че тези пътища са също така низходящите пътища на CB2. Въпреки това, нашите наблюдения предполагат, че -catenin сигнализирането се медиира от CB2-индуцирания -arrestin 1/Src комплекс. В допълнение, -arrestin 1 е главен регулатор на контролна точка и служи като протеин на скеле за иницииране на активирането на - катенин чрез преместването му в ядрото. Друго ново откритие е, че CB2 е мишена на -catenin. Няколко мишени на -catenin са били идентифицирани преди това CB2 беше идентифициран в това проучване. Следователно е забележително, че CB2/-catenin пътят изглежда създават реципрочна верига за активиране, която съвместно насърчава патогенезата на бъбречната фиброза.

В обобщение, нашите резултати предполагат, че аберантно експресираният CB2 е критично включен в бъбречната фиброза чрез -арестин 1-индуцирано -катенин активиране. -катенинът задейства експресията на CB2, което улеснява рецепторното активиране и предаването на сигналната вълна. Тези резултати (i) илюстрират нов CB2/-catenin път, който насърчава бъбречната фиброза и (ii) предполагат, че целевото инхибиране на CB2 или -арестин 1 може да предпази от фиброза чрез инхибиране на реципрочната верига на активиране.

КРАТКИ МЕТОДИ

За подробни методи вижте Допълнителните методи.

Модели на животни

Мъжки мишки C57BL/6 бяха закупени от Центъра за експериментални животни на Южния медицински университет (Гуанджоу, Китай). За IRI модела, двустранните педикули бяха подрязани от скоби за микроаневризми за 32 минути при 37,5 градуса по време на исхемията и периода на възстановяване. UUO моделът беше установен чрез тройно лигиране на левия уретер с 4-0 коприна след разрез по средната коремна линия. За модела UIRI, левите крачета бяха изрязани за 35 минути с помощта на скоби за микро-аневризма, а контралатералнатабъбрекбеше отстранен 1 ден преди жертвоприношението. За модела на индуцирана от фолиева киселина нефропатия, мъжки мишки C57BL/6 бяха третирани с фолиева киселина чрез единична интраперитонеална инжекция от 25 mg/kg телесно тегло. In vivo експресията на Wnt1 или CB2 или нокдаун на -арестин 1 при мишки беше извършена чрез хидродинамичен подход за доставяне на ген.",5 Подробните експериментални проекти са показани на фигури 5а, 7а и 9а. Експериментите с животни бяха одобрени от Комитета по етика на животните към Южния медицински университет, Гуанджоу, Китай Двойките за размножаване на CB2 нулеви мишки (CB2/) на възраст 6-8 седмици, на фона на C57BL/6N, бяха закупени от Cyagen Biosciences (стоков номер KOCMP{ {19}}Cnr2; Cyagen Biosciences, Гуанджоу, Китай). Дефицитът на CB2 рецептор е потвърден чрез обратна транскрипция-PCR.

Проби от биопсия на човешки бъбрек и клетъчна култура

Човекбъбрексрезове (3 μm) са получени от бъбречни биопсии, извършени в болница Nanfang и Народна болница на окръг Huadu, Южен медицински университет, Гуанджоу, Китай. Нормалните контролни биопсии са получени от нетуморнибъбрекносни кърпина пациенти с бъбречен карцином. Проучванията, включващи срезове на човешки бъбрек, са извършени с информирано съгласие на пациента и са одобрени от институционалната комисия по етика в болницата Нанфанг и Народната болница на окръг Хуаду. Човешки проксимални тубулни епителни клетки (HKC-8) бяха осигурени от д-р Lorraine C. Racusen (Университет Джон Хопкинс, Балтимор, MD). Ядрените и цитоплазмените фракции бяха разделени с търговски комплект (BestBio, Шанхай, Китай).

Определяне на серумния креатинин и нивата на уреен азот в кръвта

Серумният креатинин и нивата на урейния азот в кръвта се определят от автоматичен химичен анализатор (AU480 Chemistry Analyzer, Beckman Coulter, Atlanta, GA).

In situ хибридизация

Сондите CB2 бяха закупени от Boster Technology, Ухан, Китай.Бъбрексрезове (8 μm) бяха фиксирани с 4% формалдехид и оценени чрез флуоресцентно оцветяване на CB2 с ​​помощта на търговски комплект (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, China).

Хистология и имунохистохимично и имунофлуоресцентно оцветяване

Вграден в парафинбъбрексрезовете бяха оцветени с помощта на периодична киселина-Шиф и трихромно оцветяване на Масън за идентифициране на наранени тубули и определяне на отлагането на колаген. Лезиите бяха количествено определени с помощта на компютърно подпомагана техника. Имунохистохимично и имунофлуоресцентно оцветяване се извършва съответно в парафинови и замразени срезове. Антителата са описани в Допълнителните методи.