ЧАСТ Ⅰ: Ефекти от условията на околната среда върху броя на нефроните
Mar 20, 2022
за повече информация:ali.ma@wecistanche.com
ЧАСТ Ⅰ: Ефекти от условията на околната среда върху броя на нефроните: Моделиране на майчино заболяване и епигенетична регулация при бъбречно развитие
Ларс Фурман, Саския Линднер, Александър-Томас Хаузер, Клеменс Хьозе и др.
1. Въведение
Развитието на плода се влияе от вътреутробната среда и неблагоприятната среда може да предразположи към заболявания като хипертония, сърдечно-съдови заболявания и хронични бъбречни заболявания по-късно в живота [1-4]. Редица вътрематочни смущения могат да доведат до намаляване на наличността на нефрони и компрометирана бъбречна функция в потомството. При гризачи състоянията, водещи до намален брой нефрони при раждането, включват вътрематочно ограничаване на растежа (IUGR), диета с ниско съдържание на протеини на майката, лекарства (включително кортикостероиди или нестероидни противовъзпалителни лекарства), моногенетични мутации и ниски нива на витамин А, както и диабет на майката и дефицит на желязо [5-10]. При хората понастоящем няма неинвазивен метод за измерване на броя на нефроните. Проучванията след смъртта обаче показват отрицателна корелация между броя на нефроните и кръвното налягане [4,11]. Освен това е известно, че вътрематочните състояния, свързани с намален брой нефрони, като IUGR, са свързани с повишени нива на хипертония и ХБН[12].
Експериментите in vivo, при които изкуствено се предизвикват неблагоприятни вътрематочни състояния при бременни животни, се оказаха безценни за откриването и описанието на бъбречните изменения, предизвикани в потомството. Въпреки това, всяка експериментална намеса по време на бременност води до сложни промени във физиологията на майката, плацентата и плода, които сами по себе си могат да повлияят на средата на развиващите се метанефрии. Техниките за моделиране ex vivo заобикалят това, като позволяват изследването на развитието на бъбреците, напълно отделено от влиянието на животното майка, плацентата или други органи на плода. Изолирани култури от метанефрои върху интерфейс среден въздух първоначално са извършени от Trowell през 1950 г. [13] и впоследствие са прецизирани чрез култивиране на бъбреци върху филтърни мембрани [14], осигурявайки основа за условия на култура с една променлива.
В обобщение, има все повече доказателства, които предполагат, че пренаталните инсулти, свързани с нисък брой нефрони, са от значение за рисковите фактори за хипертония и ХБН. За да се разработят превантивни стратегии за осигуряване на адекватно нефронно дарение при раждането, е необходимо механично разбиране на факторите, влияещи върху развитието на бъбреците и нефрогенезата. В настоящата работа метанефричната органна култура беше използвана за моделиране на различни аспекти на регулирането на околната среда, за да се проучат техните ефекти върху бъбречния растеж и възможните последици за дългосрочната бъбречна функция и се използва за скрининг за епигенетични регулатори, използвайки одобрени от FDA малки съединения.
Щракнете върху Cistanche herba продукти за бъбречна функция
2. Резултати
2.1. Използване на метанефрични органни култури за изследване на ефекта от условията на околната среда върху бъбречното развитие
За да се моделират неблагоприятни условия на околната среда, бъбреците от ембриони от ембрионален ден (E)12.5 се култивират в интерфейса среден въздух (Фигура 1А). За да се улесни наблюдението на развитието на нефрона и гломерула, Six2. Кре и Под. Използвани са съответно двойни флуоресцентни репортерни мишки Cre (Фигура 1В, С). Често срещано състояние по време на бременност е треската, която засяга повече от 10 процента от бременностите през първите 16 гестационни седмици [15] Топлината е добре характеризиран тератоген и е доказано, че хипертермията по време на бременност води до аборт на плода, забавяне на растежа, и дефекти в развитието, като бъбречна агенезия, хипоплазия и ниско тегло при раждане при няколко вида [16-21]. За да се оцени въздействието на продължителни хипертермични състояния с висока температура върху растежа на бъбреците и образуването на нефрони, бъбреците бяха изолирани и поддържани при 37 или 40 градуса (Фигура 1D). След 7 дни култивиране, бъбреците, култивирани при 40°C, са средно с 18,36 процента по-малки от техните двойници, култивирани при физиологични условия (Фигура 1E). Въпреки това, не е открита значителна разлика в броя на гломерулите на бъбрек между групите (Фигура 1F). Въпреки това, намаленият общ растеж на бъбреците показва отрицателен ефект от повишената температура върху метанефричния растеж.
При приблизително 19 процента от бременните жени, страдащи от желязодефицитна анемия [22], дефицитът на желязо е едно от най-разпространените състояния с потенциал да наруши развитието на бъбреците [23]. Данните in vivo показват, че бъбречният растеж, броят на гломерулите и усвояването на желязо от бъбреците са намалени по време на бременност, засегната от дефицит на желязо при майката [24]. За да се оцени въздействието на намаленото снабдяване с желязо, свързано с трансферин, върху растежа на бъбреците и нефрогенезата, експлантите се култивират в среда, съдържаща 50 ug/mL наситен с желязо холо-трансферин или 50 ug/mL обеднен на желязо апо-трансферин, съответно. Ограничените от желязо бъбреци остават много по-малки от техните достатъчни с желязо колеги и показват повишена апоптоза в уретерните пъпки и намалено разклоняване и пролиферация на уретерните пъпки (Фигура 1G, допълнителна фигура S1A-F). Докато популацията на нефрона беше морфологично незасегната, можеше да се види намаляване на развиващата се дистална част на нефрона, както и дисталните тубули (Фигура 1H,I, Допълнителна фигура S1G-J). Бъбреците с дефицит на желязо са били средно 47,9 процента от размера на техните двойници, култивирани с холо-трансферин (Фигура 1) и показват намаляване на общия брой гломерули на бъбрек от 69,9 процента след 7 дни в култура (Фигура 1K) . По този начин, изчерпването на желязото от апо-трансферин показва сериозни ефекти върху растежа на бъбреците с изцяло проксимален нефрогенезен фенотип.
Фигура 1. Използване на култури от метанефрични органи за изследване на ефекта от условията на околната среда върху развитието на бъбреците.(A) Урогениталния ръб от миши ембриони E12.5 (ляв панел) беше микрохирургично екстрахиран (втори панел), а бъбреците бяха изолирани (трети панел) и поставени върху Transwell вложки （десен панел）. Скала ∶ 1 mm （ляв панел）, 500 μm（трети панел）. (B) Трансгенни мишки с двойна Tomato/EGFP експресия бяха използвани за условно маркиране на Six2-положителни клетки и тяхното потомство с помощта на Six2. Cre или (C) подоцин-положителни клетки, използвайки Pod. Cre мишки. (D) Експланти от същия ембрион се култивират в продължение на 7 дни при 37 или 40 градуса. Скала ∶ 500 μm. （E） Повърхностни площи на експланти, отглеждани в продължение на 7 дни при 37 или 40 градуса .n=40 двойки, сдвоен t-тест, средна стойност±SD.(F) Броят на гломерулите в групите експланти след 7 дни.n{{ 17}} двойки, сдвоен t-тест, средно ±SD. （G） Експланти от същия ембрион се култивират в продължение на 7 дни в среда, съдържаща holo-Tf или apo-Tf. Скала ∶ 500 μm. (H) Широкополеви изображения на holo-Tf и apo-Tf култивирана двойка експланти, оцветени срещу SIX2 и E-кадхерин след 48 часа култура, показват нормален пул от прогениторни клетки и дефекти в ранната морфология на нефрона. Скала ∶100 μm.（I） Широкополеви изображения на holo-Tf и apo-Tfкултивирана двойка експланти, оцветени срещу WT1 и JAG1. Скала ∶100 μm. （） Повърхностни площи на holo-Tf и apo-Tf култивирани експланти след 7 дни.n=30 двойки, сдвоен t-тест, средно ± SD.(K) Брой гломерули в групите експланти след 7 дни.n =17 двойки, сдвоен t-тест, средна стойност ± SD.
2.2. Ex vio експозицията на висока глюкоза води до свързани с диабетна нефропатия промени в развиващия се бъбрек
Диабетът при майката е друго често срещано състояние по време на бременност, с глобално разпространение на хипергликемия по време на бременност от ~ 17 процента и над 20 милиона живородени всяка година [25]. Показано е, че диабетът, индуциран при модели на мишки и плъхове, води до потомство с по-нисък брой нефрони [10,26,27]. Метанефричната органна култура е била използвана преди за изследване на ефекта от високата глюкоза върху бъбречното развитие [27-29]. Преди това докладвахме за намаляване на размера, броя на нефроните и метилирането на ДНК при условия на висока глюкоза от 55 mM[30]. За разлика от публикуваните данни [28], не може да се види ефект върху размера на експлантата или гломерулния брой в нашите проби, когато се култивират в различни 30 mM глюкозни среди в сравнение с 5 mM контролни условия след 7 дни (допълнителна фигура S2A, B). Освен това не може да се открие намаляване на метилирането на ДНК при LINE -1 и основните сателитни сайтове (допълнителна фигура S2C, D). Ефектът от 55 mM висока глюкоза върху развитието на бъбреците след 7--дневна култура беше допълнително анализиран, показвайки намаляване на скоростта на растеж, започвайки от ден 3 в културата (Фигура 2A, B). Имунофлуоресцентните оцветявания не показват морфологични дефекти на SIX2-положителния пул от прогениторни клетки (Фигура 2C), но показват намалено оцветяване на подоцитен маркер подокаликсин (PODXL, Фигура 2D). Установено е, че гломерулите съдържат удебелен гломерулен основен матрикс, видим в хистологичните оцветявания (Фигура 2E). Подобни констатации са направени при електронна микроскопия, показваща увеличаване на дебелината на гломерулната базална мембрана (Фигура 2F), един от най-ранните маркери за преддиабет и диабетна нефропатия (DN) [31,32], в пет от шест бъбрека и нито един от седем контролни бъбрека на котило. За по-нататъшно разкриване на промените в транскриптома беше извършен анализ на диференциална генна експресия (DGE) на двойки на бъбречни култури от три котила, като един бъбрек от всеки ембрион беше култивиран с висока глюкоза, а другият с контролна среда и бъбреците бяха събрани за анализ ( n=3).DGE потвърди регулирането на компонентите на извънклетъчния матрикс като първичен регулиран нагоре биологичен процес (допълнителна таблица S1). Понижено регулираните гени са включени главно в (имунната) клетъчна активация и екзоцитоза/секреция (допълнителна таблица S1). Онтологията на фенотипа на бозайниците показва анормален бъбречен кортекс и морфология на бъбречния корпускул поради понижени гени като Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb и Vegfa (допълнителна таблица S1). Установено е, че бъбречната експресия на няколко гена, като Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa и Txnip, за които е доказано, че се регулират нагоре при диабетна нефропатия [33-36], се повишава при хипергликемични състояния. За да се сравни профилът на генна експресия на бъбречна култура с висока глюкоза с човешки DN, DGE данните бяха съпоставени с данни за хора от микродисектирани гломерули и тубули от биопсии на пациенти с диабетна нефропатия от Европейската бъбречна cDNA банка (ERCB). От 216 диференциално регулирани гени, съпоставени след партиден анализ, 94 гена бяха съответно диференциално регулирани в гломерулните и/или тубулните фракции (Фигура 2G). Припокриването на нашия модел и човешки DNгени показа 40 от 95 гена, регулирани нагоре в гломерулите и 34 гена в тубулите (25 общи гена) (Фигура 2H). Гените участват най-вече в организацията на извънклетъчния матрикс (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) и клетъчната адхезия (ITGBL1, CLDN15). Освен това, свързаните с диабета гени като TXNIP, SPON2 и PAPPA бяха регулирани нагоре. От 120 регулирани надолу гени от бъбречни култури, 22 също са били регулирани надолу в гломерулите и 39 също са били регулирани надолу в тубулите (общо 16 (Фигура 2I). Тези гени са били включени в отговор на ендогенен стимул (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), развитие на нефронния епител (PTPRO, PODXL, VEGFA) и положителна регулация на хемотаксиса на ендотелните клетки (LGMN, P2RX4, VEGFA).В допълнение, свързаните с диабета гени като RASGRP3, SIRPA, GATM и ESM1 бяха регулирани надолу [ 37-39]. Диференциално регулираните гени, които не се припокриват с данните от ERCB, също отразяват промени, свързани с диабета, като екстрацелуларен матрикс (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) или гестационен диабет (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). По този начин развитието на бъбреците при условия на висока глюкоза показва забележителни прилики с диабетна нефропатия при възрастни хора.
Фигура 2. Ex vivo висока експозиция на глюкоза води до свързани с диабетна нефропатия промени в развиващия се бъбрек.(A) Ембрионални бъбреци от Pod.Cre; Домати/EGFP животни, култивирани в продължение на 7 дни при условия на ниска глюкоза (LG, 5,5 mM -D-глюкоза, 55 mM манитол) или висока глюкоза (HG, 55 mM -D-глюкоза). Скала: 500 um. (B) Площ на бъбречната повърхност при HG и LG състояния.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex vivo въздействие на високата експозиция на глюкоза върху формирането на дълготрайна памет чрез метилиране на ДНК
За по-нататъшно разбиране на молекулярните промени, медиирани от хипергликемична среда, бъбречните култури се отглеждат при условия на висока глюкоза в продължение на 3,5 дни и след това се променят на условия на ниска глюкоза за същия период от време (Фигура 3А). Забележително е, че инкубацията при физиологични условия след по-краткия инкубационен период в среда с високо съдържание на глюкоза не обърна намаляването на растежа след 7 дни в културата, като културите растат със същата скорост, както при непрекъснато третиране с висока глюкоза (Фигура 3В). Освен това, ДНК метилирането показа хипометилиране на LINE-1 елемента и основните сателитни локуси (Фигура 2C, D), както и продължително ДНК хиперметилиране на Ppargcla промотора, както при висока глюкоза, така и при обратни условия (Фигура 3E), което показва, че формиране на метаболитна памет чрез метилиране на ДНК поради по-ранните неблагоприятни условия на околната среда като средство за фетално програмиране.
Фигура 3. Ex vivo висока експозиция на глюкоза влияе върху формирането на дългосрочна памет чрез метилиране на ДНК.(A) Изобразяване на E12.5 ембрионални бъбреци от ден 0 до ден 7 в среда с ниско съдържание на глюкоза (5,5 mM), среда с високо съдържание на глюкоза (55 mM) или среда с високо съдържание на глюкоза за 3,5 дни и обръщане към среда с ниско съдържание на глюкоза за останалите дни. Мащабна лента: 500 um. (B) Площ на бъбречната повърхност за 7 дни. Средно ± SD. n=36 бъбреци. LG, лечение с ниска глюкоза; HG, лечение с висока глюкоза; HG към LG, 3,5 дни лечение с висока и 3,5 дни ниска глюкоза.***, LG-HG (несдвоен t-тест): p=0.0004;**, LG-HG към LG (сдвоен t-тест ):стр<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ex vivo Small Compound Screen идентифицира епигенетичните регулатори на бъбречното развитие
Резултатите от тази работа, както и от предишни работи, предполагат, че епигенетичните механизми играят роля в развитието на бъбреците [30, A40-45]. Следователно, ние искахме систематично да оценим ефекта на епигенетичните модулатори на различните класове ензими върху бъбречното развитие. За това избрахме библиотека от 22 одобрени от FDA малки съединения с демонстрирана инхибиторна активност [46-56] (Фигура 4А). Като се използват Six2.Cre-репортерни мишки за оценка на развитието на нефрон, бъбречните структури се култивират в продължение на 3 дни с инхибиторите в средата. Размерът се увеличава с времето в сравнение с контролните органи на котилото и морфологията е проверена за аномалии в развитието (Фигура 4B). Може да се докаже, че няколко инхибитора пречат на нормалното ex vivo развитие на бъбреците. HDAC инхибитор ентиностат, инхибитор на бензамид хистон деацетилаза с висок афинитет към HDAC1, 2 и 3 [57], показва постоянно намаляване на растежа и липса на диференциация и пролиферация след 3 дни (Фигура 4C). TH39 се развива като селективен HDAC8 инхибитор (IC50 HDAC8 88 nM, 26-кратно селективен срещу HDAC1,28-кратно селективен срещу HDAC6[56]), показа подобно силно инхибиране на растежа в сравнение с контролните органи на котилото. Освен това хелаторите на желязото и инхибиторите на JmJC деферазирокс и дефероксамин показват намаляване на растежа, аналогично на желязодефицитната среда. Освен това, инхибиторът на SET7/9 ципрохептадин [58, 59] показва намаляване на растежа и липса на диференциация и пролиферация в сравнение с контролните бъбреци (Фигура 4D), но също така изглежда, че пречи на сигнализирането на Wnt (допълнителна фигура S3). Други HDAC, HAT, HDM и HMT инхибитори и DNMT инхибитор 5-азацитидин не показват намаляване на растежа или аномалии в развитието в рамките на измерената времева рамка (Фигура 4A).
Фигура 4. Ex vivo малък съставен екран идентифицира модулатори на бъбречното развитие.(A) Списъкът на малките съединения, техните епигенетични цели и използваната концентрация показва намаляване на бъбречния растеж с ентиностат, TH39, деферазирокс, дефероксамин и ципрохептадин в По-голямо или равно на 3 независими експеримента след 3 дни в култура. Контролните култури се третират с DMSO. ***, p-стойност<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
