Решаващите роли на TRPM6 в циркадната регулация на кръвното налягане

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Значението на бъбречния йонен канал TRPM6 в циркадната секреция на ренин за повишаване на кръвното налягане

Йосуке Фунато, Дайсуке Ямазаки, Дайсуке Окузаки, Нобухико Ямамото и Хироаки Мики

Кръвно наляганеима дневен модел, с по-високи стойности в активния период. Повишаването му в началото на активния период значително повишава риска от фатални сърдечно-съдови инциденти. Секрецията на ренин, стимулирана от бъбречните симпатикови неврони, се счита за съществена за този процес; неговият регулаторен механизъм обаче остава до голяма степен неизвестен. Тук показваме важността напреходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6 (TRPM6), Mg2 плюс -пропусклив катионен канал, за увеличаване на секрецията на ренин в активния период.TRPM6експресията е значително намалена в дисталния извит тубул на хипотензивни мишки с дефицит на Cnnm2-. Ние генерираме специфични за бъбрецитеTRPM6-дефицитни мишки и наблюдават намаляване накръвно наляганеи изчезване на неговата циркадна вариация. Последователно секрецията на ренин не се увеличава в активния период. Освен това, секрецията на ренин след фармакологично активиране на -адренорецептор, мишената на невронна стимулация, се отменя и експресията на рецептора се намалява в клетките, секретиращи ренин. Тези резултати показват решаващата роля наTRPM6 в циркадната регулация накръвно налягане.

Смята се, че приблизително един милиард души по света имат хипертония, което значително увеличава риска от различни заболявания, включително потенциално фатални заболявания, като исхемична болест на сърцето и инсулт. Известно е, че тези фатални инциденти, свързани с хипертония, се случват често рано сутрин, в началото на активния период, когатокръвналяганесе повишава рязко. Смята се, че секрецията на ренин, предизвикана от бъбречните симпатикови неврони, играе решаваща роля в товакръвно наляганенадморска височина, но неговият регулаторен механизъм не е добре разбран².

цистанче бодибилдинг

Широко прието е, че някои хранителни минерали, особено натрий и калий, играят важна роля в контрола накръвналягане. Магнезият е основен основен елемент, участващ в различни биологични дейности. Епидемиологичните проучвания показват значителна обратна връзка между нивата на магнезий в храната и риска от хипертония3-6. Освен това, екскрецията на магнезий в урината, за която се приема, че е в приблизително равновесие с чревната абсорбция на магнезий, е обратно пропорционална на риска от хипертония. Тези открития предполагат тясна връзка между магнезиевата хомеостаза в организма икръвно наляганерегулиране, подчертаващо значението на Mg2 плюс канали и/или транспортери в регулирането накръвно налягане.

Голямо количество магнезий постоянно се реабсорбира в бъбреците. По-голямата част от магнезия в гломерулния филтрат се реабсорбира в дебелия възходящ край на бримката на Хенле, но последната стъпка на реабсорбция се извършва в дисталния извит тубул (DCT)8. Последният процес е строго регулиран, за да се регулира количеството на реабсорбция до ниво, подходящо за поддържане на магнезиева хомеостаза. Геномни анализи на вродени заболявания със симптоми на хипомагнезиемия разкриват няколко ключови молекули, участващи в този процесTRPM6, кодиранепреходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6(TRPM6), който е мутиран при пациенти с рецесивна хипомагнезиемия с вторична хипокалцемия 2,10.TRPM6образува Mg2 плюс-пропусклив йонен канал, локализиран към апикалната мембрана на DCT клетки и медиира приема на Mg2 плюс от тубулния лумен1. Друга ключова молекула е циклин M2 (CNNM2) и Mg2 плюс транспортер, локализиран към базолатералната мембрана на DCT клетки 12, 13. Cnnm2 мутациите причиняват фамилна доминантна хипомагнезиемия, която се характеризира с дефекти в реабсорбцията на магнезий в бъбрека2. Cnmm2-мишките с дефицит показват подобни симптоми на хипомагнезиемия с загуба на магнезий в бъбреците4. Точната молекулярна роля на CNNM2 все още е спорна, но няколко линии доказателства сочат, че той медиира Mg2 плюс ефлукс от DCT клетки през базолатералната мембрана5, като по този начин допринася за реабсорбцията на магнезий. Допълнителни анализи на мишки с дефицит на Cnnm2-разкриха, че тези мишки също имат значително по-нискикръвналяганеотколкото контролните мишки4. Въпреки това, механичните детайли и участието на други Mg2 плюс канали/преносители в товакръвналяганерегламент остават неизвестни.

Известно е също, че бъбречната DCT играе критична роля вкръвналяганерегулиране, тъй като значително реабсорбира натрий и регулира обема на телесните течности6. Редица катионни канали/транспортери, като Na-Cl ко-транспортер (NCC), епителен натриев канал (ENaC) и Na плюс /H плюс обменник 2 (NHE2), се експресират в DCT апикалната мембрана и някои от тези протеини медиират приема на Na плюс в DCT клетки от тубулния лумен. След това вътреклетъчният Na plus се екструдира от клетките през базолатералната мембрана от Na plus /K plus -ATPase, за да се извърши неговата реабсорбция. Освен прякото участие в регулирането на обема на телесните течности, DCT е разположен в непосредствена близост до макулата денса, която контролира секрецията на ренин, хормон с основна роля в оркестриранетокръвно наляганенаредба17,18. Чрез усещане на нивата на Cl- в урината, клетките на макулата денса стимулират близките юкста-гломерулни (JG) клетки да секретират ренин.

В тази работа ние извършваме анализи на транскриптоми с бъбреци на хипотензивни мишки с дефицит на Cnnm2-. Откриваме значително намаляване наTrpm6, което ни подтиква да генерираме специфични за бъбрецитеTrpm6-мишки с дефицит. Неочаквано, анализите на този щам на мишка разкриват фенотип, качествено различен от този на дефицит на Cnnm2-: загубата на циркадните вариации накръвналягане. Откриваме също, че този фенотип е причинен от нарушена секреция на ренин, aкръвно налягане-повишаващ хормон, чието кръвно ниво обикновено е повишено по време на активната фаза.

цистанче бодибилдинг

Резултати

Понижаване на регулацията наTRPM6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)експресия при мишки с дефицит на Cnnm2-. За изследване на молекулярния механизъм накръвно наляганенамаляване на мишките с дефицит на Cnnm{0}}, извършихме анализи на ДНК микрочипове, за да изследваме промените в генната експресия в бъбрека на Cnnm2f/il; Шест2-Cre мишки, без двата Cnnm2 алела в бъбрека4. Сред диференциално експресираните гени (Таблица 1) избрахме да анализираме Pvalb иTrpm6, като и двете са изразени в DCT919. Количествените PCR (qPCR) анализи разкриха товаTrpm6експресията е намалена по подобен начин в бъбреците и на двата Cnnm2fi; Шест2-Cre и Cnnm2 плюс / мишки. Тъй като и Cnnm2 плюс /A и Cnnm2fi/; Анализирахме шест2-Cre мишки с хипотония4TRPM6 израз по-подробно. Имуноблотинг анализите на бъбречните лизати потвърждават значително намаляване наTRPM6на нивото на протеина от дефицит на Cnnm2-, докато нивата на NCC и фосфорилиран NCC (активна форма) не са засегнати значително, експресията на CNNM2 е потвърдена чрез последователни имунопреципитационни и имуноблотинг анализи). Намаляването наTRPM6в бъбреците на Cnnm2f/i; Шест2-Cre мишки също бяха потвърдени чрез имунофлуоресцентни анализи.

Ние също прегледахмеTRPM6експресия при мишки без CNNM4, които също показват симптоми на хипомагнезиемия20, но имат повишеникръвно налягане4. Имуноблотинг и имунофлуоресцентни анализи показват, чеTRPM6експресията се увеличава в DCT клетки на мишки с дефицит на Cnnm4-, което предполага, чеTRPM6изразът е тясно свързан скръвно наляганестойности, но не е пряко свързано с нивата на магнезий в кръвта.

Регулиране наTRPM6експресия чрез вътреклетъчен Mg2 плюс в DCT клетки. За характеризиране на молекулярния механизъм наTRPM6 понижаваща регулация при мишки с дефицит на Cnnm2-, ние използвахме клетъчна линия MDCT21, получена от DCT, която експресира доминантно Cnnm2 и умерено Cnnm3 и Cnnm4 сред гените на семейство Cnnm. Тъй като CNNM2 и CNNM4 имат силна Mg2 плюс ефлуксна активност, докато CNNM3 няма Mg2 плюс ефлуксна активност15, ние извършихме нокдаун, медииран от малка интерферираща РНК (siRNA) на Cnnm2, Cnnm4 или и на двете. Нокдаунът на Cnnm2 увеличи вътреклетъчните нива на Mg плюс ([Mg плюс ]), а едновременното нокдаун на Cnnm4 доведе до леко повишаване на средната стойност [Mg2]; стойност, която не е статистически значима. След това прегледахмеTrpm6експресия чрез qPCR и установи значително намаление след нокдаун на Cnnm2 и много по-голямо намаление след двойното нокдаун на Cnnm2 и Cnnm4. Следователно,Trpm6експресията изглежда се регулира отрицателно от вътреклетъчните нива на Mg2 плюс, което е в съответствие с предишните доклади23. За да изследваме директно значението на Mg2 плюс, ние култивирахме MDCT клетки в среда с различни концентрации на Mg2 плюсTrpm6експресия, което предполага супресивна роля на Mg2 плюс. В случай на двойни нокдаун (Cnnm2/Cnnm4) MDCT клетки,Trpm6експресията беше потисната с намаляване на Mg2 плюс

плюс концентрации до 0.2 mm, но по-нататъшните намаления отменят потискащия ефект; както вътреклетъчен Mg2 плюс, така иTrpm6нивата не се различават значително от контролните siPHK-трансфектирани клетки и при 0.1 и 0.02 тМ условия. Тези резултати показват зависим от Mg2 плюс регулаторен механизъм наTrpm6израз, който обясняваTrpm6понижаване на регулацията в бъбреците на Cnnm2-мишки с дефицит.

Условно прекъсване наTrpm6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)в бъбрека. След това имахме за цел да генерирамеTrpm6-дефицитни мишки за по-нататъшно изследване на важността наTRPM6в регулацията накръвно налягане. Използвахме клонинг на ембрионални стволови (ES) клетки, носещи рекомбинантTrpm6алел (Trpm6-), която съдържа акцепторна последователност на снаждане, принуждаваща преждевременно снаждане на иРНК и водеща до иРНК, съкратена след екзон 6. Химерни хетерозиготни мишки бяха получени чрез бластоцистно инжектиране на ES клетки и рекомбинацията беше потвърдена с PCR. Кръстосахме тезиTrpm6плюс /- мишки, но неTrpm6-/--off_пружини бяха получени. Този резултат е в съответствие с предишни доклади, показващи ембрионална смъртност вTrpm6-мишки с дефицит24,25

Затова извършихме специфично за бъбреците условно разрушаване наTrpm6използвайки Six2-Cre, което позволява ефективната и специфична експресия на GFP-слята Cre рекомбиназа в ембрионалния бъбрек.Trpm6fl/, Шест2-Cre мишки (специфични за бъбрецитеTrpm6-мишки с дефицит) са родени при очакваното Менделово съотношение. За определяне на израза наTRPM6, извършихме имуноблотинг анализи, използвайки анти-TRPM6антитяло.TRPM6нивата на протеини бяха силно намалени в бъбреците наTrpm6fl/fl, Six2-Cre мишки, но не са наблюдавани значителни промени в други органи. Анализите на имунофлуоресцентно оцветяване също не показват експресия наTRPM6в NCC-положителни DCT клетки. Не наблюдавахме значимиTRPM6-положителен сигнал в повече от 100 такива групи от NCC-позитивни клетки, което предполага, чеTRPM6експресията е почти напълно потисната в DCT клетки на Trpmfi/; Шест2-Cre мишки. Тези резултати потвърждават успешното генериране на специфични за бъбрецитеTrpm6-мишки с дефицит.

Първо проучихме ефекта на специфичния за бъбрецитеTrpm6- дефицит на магнезиева хомеостаза. Поддържахме мишки в метаболитни клетки и събрахме проби от урина и серум, които след това бяха подложени на колориметрично количествено определяне на нивата на магнезий с помощта на Xylidyl Blue-I. Серумните нива на магнезий са значително по-ниски вTrpm6л/л; Шест2-Cre мишки в сравнение с тези в контролатаTrpm6плюс / плюс ; Шест2-Cre мишки, докато нивата на магнезий в урината са по-високи. Ние също така извършихме анализи с индуктивно свързана плазмена емисионна спектроскопия (ICP-ES), за да измерим няколко основни метални елемента в серума и установихме, че само нивата на магнезий са значително засегнати в Trpmd/; Шест2-Cre мишки. Тези резултати ясно показват, че мишки с бъбречен дефицит на Trpm6- имат хипомагнезиемия с загуба на магнезий в бъбреците, както се наблюдава при мицел със специфичен за бъбреците Cnnm2-дефицит4.

Липса на циркадни вариации накръвналяганеи ренинова активност. След това подложихмеTrpm6I л; Шест2-Cre мишки докръвналяганеизмервания с помощта на радиотелеметрия. Систолно и диастолнокръвно наляганестойностите бяха значително по-ниски вTrpm6л/; Шест2-Cre мишки в сравнение с контролните мишки. Трябва да се отбележи, че обичайната циркадна вариация накръвно налягане, с високи стойности през тъмния период и ниски стойности през светлия период при мишки, не се наблюдава приTrpm6f/l; Шест2-Cre мишки. За да проверим дали циркадният ритъм протича нормално, използвахме радиотелеметрия за измерване на локомотивната активност на мишки и потвърдихме много ясна циркадна вариация вTrpm6л/; Шест{{0}}Cre мишки. Ние също така изследвахме кръвните нива на вазопресин (AVP) и нивата на иРНК на два часовникови гена Bmall и Per2 в мозъка и бъбреците; за всички е известно, че показват типична циркадна вариация 27, 28. Анализирахме в шест различни времеви точки (при 0,4,8 zeitgeber times(ZT) за светлия период и при 12,16,20 ZT за тъмния период). Контролните мишки показват ясни циркадни модели на тяхната експресия, както беше съобщено по-рано 28, и отново не открихме значителни аномалии вTrpm6/I л; Шест2-Cre мишки. Ние също проверихме нивото на експресия на Trpm7, което кодира Mg2 плюс -пропусклив канал, тясно свързан сTRPM6, в бъбрека. Моделите на изразяване бяха много сходни и при дветеTrpm6плюс / плюс ; Шест2-Cre и Trpm6f/; Шест2-Cre мишки и не показват ясни циркадни модели. Колективно заключаваме, че циркадният ритъм протича нормалноTrpm6i; Шест2-Cre мишки. Счита се, чекръвналяганеповишаването по време на активния период (тъмния период за мишките и светлия период за хората) както при хората, така и при мишките възниква в отговор на увеличаване на секрецията на ренин в кръвта2. Измерихме активността на ренин в кръвни проби, събрани в шестте различни времеви точки, описани по-горе. Наблюдава се ясно повишаване на активността на кръвния ренин по време на тъмните периоди в проби от контролни мишки, но не се наблюдава значително увеличение в пробите от тези наTrpm6/lSix2-Cre мишки. Ние също така измерихме кръвното ниво на норадреналин, чието освобождаване е известно, че се стимулира от активирането на системата ренин-ангиотензин 29, 30. Както се очакваше, тяхната циркадна вариация също изчезна вTrpm6, Шест2-Cre мишки. Междувременно, протеиновото ниво на кръвния ангиотензиноген (AGT), друга ограничаваща скоростта молекула за активиране на системата ренин-ангиотензин при мишки31, не се повлиява отTrpm6 дефицит. Резултатите предполагат, че нарушената циркадна вариация на ренина е важна за загубата на циркадна вариация накръвналяганеотTrpm6-дефицит.

Близостта наTRPM6-експресиращи клетки към ренин-секретиращи клетки. Ренинът се експресира и секретира от JG клетките в бъбреците 17, 18. JG клетките са в пряк контакт с macula densa, която е разположена в съседство с DCT и стимулира секрецията на ренин от JG клетките в отговор на намаляването на нивата на Cl в урината18. Имунофлуоресцентното оцветяване за ренин и невронална азотен оксид синтаза (nNOS), маркер за макула денса, не показва аномалии нито в модела, нито в интензитета на положителните сигнали, наблюдавани близо до гломерулите вTrpm6f/; Шест2-Cre мишки. Следователно, клетките, които участват пряко в секрецията на ренин и неговата регулация, изглежда не се повлияват значително отTrpm6дефицит. КатоTRPM6е ко-експресиран с NCC в DCT, след това изследвахме пространствената връзка междуTRPM6/NCC-експресиращи клетки (DCT) и macula densa или JG клетки. Конфокалните изображения на сагиталните DCT секции показват почти пълно припокриване наTRPM6и NCC сигнали в целия DCT. След това оцветихме за nNOS и NCC и установихме, че областите, положителни за nNOS и NCC, са свързани, без никакво припокриване на сигнала. В допълнение, двойното оцветяване за ренин иTRPM6/NCC разкри, че някоиTRPM6/NCC-експресиращите клетки са в близост до ренин-експресиращите JG клетки, което предполага, чеTRPM6/NCC-експресиращите клетки, както и macula densa, могат да имат значително влияние върху секрецията на ренин.

Нарушена секреция на ренин отTrpm6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)дефицит. Като цяло, автономната нервна система играе решаваща роля в оркестрирането на прогресията на циркадния ритъм. Смята се, че секрецията на ренин от JG клетки по време на активния период се стимулира от норадреналин, секретиран от бъбречните симпатикови неврони32. За директно изследване на ефекта от такава стимулация върху секрецията на ренин, ние подготвихме бъбречни резени и ги стимулирахме с изопротеренол, агонист на -адренорецептор (AR). Резултатите показват много ясно намаляване на ренин-положителния сигнал, оставащ в среза след стимулация с изопротеренол за 30 минути. Количествените анализи показват, че процентът на гломерулите, заобиколени от ренин-положителен сигнал, намалява от приблизително 80 процента на 30 процента след стимулация с изопротеренол, което показва появата на масивна секреция на ренин. Въпреки това, ние не наблюдавахме значителен ефект от изопротеренолова стимулация върху рениновия сигнал в бъбречни срезове отTrpm6/1; Шест2-Cre мишки. За да потвърдим резултата, ние също измерваме активността на ренин в кръвта след прилагане на изопротеренол. Резултатите показват, че значително повишаване на активността на ренина в кръвта се наблюдава само при контролни мишки, докато повишаването на сърдечната честота обикновено се наблюдава и при двата щама. Тези резултати предполагат, че ренин-секретиращите JG клетки не могат да отговорят на стимулация от бъбречни симпатикови неврони, в съответствие с изчезването на циркадното увеличение накръвналяганеи активността на ренин вTrpm6l/fl; Шест2-Cre мишки.

JG клетките могат също да бъдат стимулирани да секретират ренин в отговор на простагландини, сред които простагландин E2 (PGE2) се счита за най-важен, тъй като той се секретира физиологично от клетките на макулата денза, когато нивата на Cl- в урината намаляват 17, 18. Освен това е известно също, че PGE, лечението на бъбречни резени може да стимулира ефективно секрецията на ренин33. Стимулирането на JG клетки с PGE2 и изопротеренол обикновено активира производството на cAMP, което в крайна сметка причинява секреция на ренин. Затова тествахме и ефекта на PGE и мембранно-пропускливия cAMP аналог, дибутилил-cAMP(db-cAMP).PGE2 и db-cAMP успешно стимулират секрецията на ренин в бъбречни срезове от Trpmdi/A, Six2- Cre мишки и контролни мишки. Това показва, чеTrpm6 дефицитът не отменя общия механизъм, участващ в усещането на външни сигнали, препредаване на вътреклетъчни сигнали и извършване на секреция на ренин, но засяга специфично отговора към -AR.

Намалена експресия на -AR в JG клетки отTrpm6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)дефицит. Нарушен -AR рецепторен отговорTrpm6l/л; Шест2-Cre мишки ни накараха да изследваме състоянието на експресията на -AR рецептора и по този начин извършихме имунофлуоресценция на 1-AR, основният -AR подтип, експресиран в JG клетки34. Както беше съобщено по-рано34, ние открихме лентовиден модел на оцветяване в бъбречни участъци както на контролни, така и на Trpmdi/l, Six2-Cre мишки. Известно е, че 1-AR е силно експресиран както в кръвоносните съдове, така и в JG клетките34, и последователно 1-AR-позитивните клетки в края на лентовидно оцветяване в бъбрека на контролна мишка също са положителни за оцветяване с ренин (показано с върха на стрелка). Обратно, оцветяването на Trpm6l/fl; Шест2-бъбрек на мишка Cre показва по-малък брой 1-AR/ренин двойно положителни клетки, което предполага, че 1-AR експресията е намалена в JG клетките. За да потвърдим това откритие, ние изолирахме JG клетки чрез използване на метода на центрофугиране с градиент на плътност Percoll съгласно предишния доклад35. Имуноблотинг анализите разкриват, че ренин-позитивните JG клетки са обогатени във фракция от лента 3, което е в съответствие с техния доклад35, и 1-AR експресията в тази фракция от лента 3 е специфично много по-ниска в Trpmdi/1; Шест2-Cre мишки. Взети заедно, открихме товаTrpm6дефицитът намалява нивото на експресия на 1-AR в JG клетките, което е в съответствие с нарушената секреция на ренин.

Ефектът от изкуствената интервенция върху денонощиетокръвналяганевариация. В последния набор от експерименти тествахме ефекта от различни интервенции върху циркадния периодкръвналяганевариация. За да потвърдим важността на ренина, ние приложихме клинично достъпен инхибитор на ренин алискирен36 на мишки от див тип. катоTrpm6аблация, приложението на алискирен чрез хирургично имплантиране на осмотична минипомпа значително потиска циркадниякръвналяганевариация. След това извършихме операции на бъбречна денервация, тъй като активирането на -AR върху JG клетки през симпатиковата нервна система е основният път за стимулиране на секрецията на ренин по циркаден начин2. Отново установихме, че интервенцията потискакръвналяганевариация. Тези резултати са в съгласие с нашия модел, че дефектите в -AR отговора и секрецията на ренин са отговорни за загубата накръвно наляганевариация в Trpmdl/l; Шест2-Cre мишки.

Ние също така тествахме ефекта от повишаване на съдържанието на магнезий в храната. За тази цел мишки от див тип бяха хранени с диета с високо съдържание на Mg, съдържаща 0.6 процента (нормална диета: 0.3 процента магнезий) в продължение на 1 месец. Както се очакваше, тези мишки показаха повишени нива на Mg в кръвта. След това проверихме нивото на експресия наTRPM6при DCT; той намаля драстично чрез хранене с диета с високо съдържание на Mg и степента на намаляTRPM6експресията е по-голяма от бъбречната Cnnm2 аблация. Когато измервахмекръвно наляганепри тези мишки открихме, че мишките, хранени с диета с високо съдържание на Mg, показват значително по-малкикръвналяганевариация отколкотоTrpm6-дефицитни мишки, което е в съответствие с нашата представа, че бъбречнатаTRPM6е важен за циркадниякръвно наляганевариация.

Таблица 1 Гени, които са били регулирани нагоре или надолу в бъбреците на Cnnm2flfl/flfl; Шест2-Cre мишки.

Дискусия

В това проучване ние демонстрирахме важността наTRPM6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)в регулацията накръвно налягане. По-специално, ние показваме почти пълно изчезване на циркадната вариация накръвно наляганепри специфични за бъбрецитеTrpm6-мишки с дефицит. Ние също така открихме, че секрецията на ренин, ключов хормон, управляващ кръвното налягане, е силно отменена вTrpm6-дефицитни мишки, което е в съответствие с наблюдаванотокръвно наляганефенотип. Няколко доклада показват, че TRPM7, друг Mg2 плюс -пропусклив канал, много подобен наTRPM6, също влияе върху кръвното налягане37,38. TRPM7 предотвратява увеличаването накръвно наляганепри приложение на ангиотензин II чрез потискане на отговора на васкуларните ендотелни клетки към ангиотензин II37. Напротив, наскоро беше съобщено, че TRPM7 също улеснява повишаването накръвно наляганепри прилагане на лептин чрез медииране на Mg2 плюс приток в клетките на каротидното тяло38. По този начин ролята на TRPM7 вкръвно наляганерегламентът е двусмислен. Въпреки това, тъй като нивото на експресия на TRPM7 в бъбреците не е повлияно от бъбрецитеTrpm6аблация (допълнителна фигура 5), изглежда, че TRPM7 не участва пряко във фенотипите, наблюдавани в това проучване.

Както се наблюдава при мишки с дефицит на Cnnm2-,кръвно наляганестойностите бяха намалени вTrpm6-мишки с дефицит (фиг.2)14. Все пак трябва да се отбележи, че има ясна разлика между тези мишки. Прекъсването на Cnnm2 като цяло е намаленокръвно налягане, но циркадните вариации все още бяха ясно наблюдавани. За разлика от това, тази вариация изчезна вTrpm6-мишки с дефицит. Такава качествена разлика също е в съответствие с нашето наблюдение, че циркадната вариация на ренина е запазена при мишки с дефицит на Cnnm2- (допълнителна фигура 9). Трябва да се отбележи, че както CNNM2, така иTRPM6се смятат за важни за бъбречната реабсорбция на Mg2 плюс чрез медииране на векторния транспорт на Mg2 плюс през DCT и наистина, мишките с дефицит на двата гена показват идентичен фенотип на бъбречна загуба на Mg2 плюс (фиг. 1 и реф. 39). Качествената разлика накръвно наляганефенотип между Cnnm2-иTrpm6мишки с дефицит предполага, че транспортирането на Mg2 плюс в DCT, общата функция на двете молекули, не е пряко включено в циркадните вариации накръвно наляганеи секреция на ренин, което предполага, че CNNM2-независимата роля наTRPM6е в основата на тези интригуващи фенотипове.

Няколко механизма работят за стимулиране на секрецията на ренин от JG клетките за поддържанекръвно налягане. Сред тях се счита, че входът от бъбречните симпатикови неврони играе основна роля в увеличаването накръвно наляганепо време на активния период на циркадните вариации32. Тези неврони секретират норадреналин, който се свързва и активира -AR върху JG клетки, за да стимулира производството на cAMP, което в крайна сметка води до секреция на ренин1732. В нашите експерименти с помощта на резени от бъбрек, получени отTrpm6-дефицитни мишки, стимулиране с изопротеренол, a -AR агонист, не показва ефект върху секрецията на ренин, докато стимулацията с PGE2 или db-cAMP ефективно повишава секрецията на ренин (фиг. 4). PGE2 се секретира от macula densa в отговор на ниски нива на Cl- в урината и активира EP2 и EP4 рецепторите върху JG клетки, което, подобно на -AR активирането, в крайна сметка стимулира производството на cAMP40. Следователно, тези резултати предполагат, че -AR сигнализирането е селективно отменено в JG клетки наTrpm6-дефицитни мишки, без да се засяга низходящият сАМР-медииран сигнален път. Последователно, имунофлуоресценция на срезове от бъбрек на мишка и имуноблотинг на изолирани JG клетки разкриват, че експресията на -AR е значително намалена в JG клетките наTrpm6-мишки с дефицит (фиг. 5). Такава намалена експресия на -AR трябва да направи JG клетките неспособни да секретират ренин в отговор на стимулация на симпатиковия нерв по време на активния период, като по този начин елиминира циркадните вариации на нивото на ренин в кръвта икръвно налягане. Трябва да се отбележи, че има проучване, използващо 1/ 2-AR нокаут мишки, което показва намален циркаденкръвно наляганевариация катоTrpm6-мишки с дефицит41. Те го приписват на намалената локомоторна активност, но остава възможно намалената циркадна вариация на активността на ренин да допринася за намалената циркадна вариация накръвно наляганеe. Алтернативно, необичайният фон на техните мишки (смесен фон от C57BL6/J, 129 и VFB; използвахме чист фон C57BL6/) може да маскира ефекта на -AR върхукръвно наляганевариация; генетичният произход е от решаващо значение за циркадния периодкръвно наляганевариация42.

цистанче бодибилдинг

Как загубата наTRPM6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)в DCT клетки води до намалената експресия на -AR в JG клетките остава неуловима. Експерименти, използващи други видове клетки, показват, че експресията на -AR се регулира от различни молекули, за които е известно, че медиират междуклетъчното сигнализиране: Добавянето на глюкокортикоиди към културалната среда на клетъчна линия DDT1 MF-2, получена от vas deferens, увеличава експресията на -AR43. Също така се съобщава, че азотният оксид (NO) потиска разграждането на -AR в сърдечните клетки чрез S-нитрозилиране на GRK24. Сред тези молекули, заслужава да се отбележи, че NO се секретира от клетките на бъбречната макула денза, стимулирайки JG клетките по паракринен начин за увеличаване на секрецията на ренин45. Докато експресията на nNOS, произвеждащият NO ензим в бъбреците, е ограничена до клетките на макулата денса, те са в пряк контакт с DCT клетките, следващият сегмент на бъбречния тубул6. Следователно е възможно, чеTrpm6-дефицит в DCT клетки води до намалена експресия на -AR в JG клетки чрез повлияване на производството или освобождаването на NO от съседните клетки на макулата денса.

Известно е, че JG клетките също комуникират с други клетки чрез образуване на празнини с околните клетки, като мезангиални клетки, и получават Ca2 плюс за потискане на секрецията на ренин7. Въпреки че JG клетките и DCT клетките не контактуват директно една с друга, те все още са близо разположени (реф. 46 и фиг. 3) и е възможно тези клетки да използват комуникации чрез междинни връзки чрез намесващи се клетки, като мезангиални клетки; според съобщенията и трите клетъчни типа експресират Cx3747,48, изоформа на коннексин, която олигомеризира и представлява празнини. Допълнителен анализ може да идентифицира молекулата и пътя, отговорен за междуклетъчното сигнализиране между DCT и JG клетките, което е важно за разкриване на цялостния механизъм на нарушен циркаденкръвно наляганевариация поTrpm6-дефицит.

вTrpm6мишки с дефицит, циркадните вариации на кръвните нива не само на ренин, но и на норадреналин изчезнаха. Активирането на системата ренин-ангиотензин стимулира освобождаването на норадреналин в кръвния поток 29, 30 и следователно изглежда разумно ефектът наTrpm6 (преходен рецепторен потенциал, свързан с меластатин 6)аблацията на нивата на ренин и норадреналин в кръвта е сходна. Тъй като норадреналинът също действа върху -AR на JG клетките, за да насърчи секрецията на ренин, се приема, че двете молекули съставляват положителна обратна връзка, стимулирайки секрецията на другата. Въпреки това, трябва да се отбележи, че резултатите от експериментите с прилагане на изопротеренол изрично показват дефекта в секрецията на ренин (Фигура 4) и следователно изглежда, че това е основната причина за загубата на циркадните вариации както на ренина, така и на норадреналина.

Досега са разработени и използвани различни ефективни лекарства за лечение на пациенти с хипертония. Въпреки това, значителен брой пациенти показват резистентност към конвенционалните лечения, които използват комбинация от основни антихипертензивни лекарства с различни функционални механизми4. Хирургична денервация на бъбречни симпатикови неврони с помощта на ендоваскуларни катетри е проведена на базата на изпитания за лечение на такава резистентна хипертония50. Практическата му ефективност при подобряванекръвно наляганеконтролът е спорен51,52, но наскоро публикувани проучвания показват значително намаляване накръвно наляганев сравнение с фиктивните контроли53,54. Има също смесени резултати относно ефекта на бъбречната денервация върху циркадните вариации накръвно налягане. Някои доклади показват, че степента накръвно наляганенамалението от бъбречна денервация е по-голямо по време на активните периоди53, но други не съобщават за промяна в циркадните вариации накръвно налягане55,56. При анализа, използващ лабораторни животни, нашите операции за бъбречна денервация срещу мишки потискат циркадните вариации накръвно налягане(фиг.6). Подобни операции са извършени и срещу плъхове, но дори контролните диви плъхове не показват почти никакъв циркаденкръвно наляганевариация на първо място57,58, което затруднява оценката на ефекта от операцията. Необходими са повече проучвания, за да се изясни влиянието на бъбречната денервация върху циркадния периодкръвно наляганевариация, което също би ни помогнало да разберем по-подробния механизъм накръвно наляганедисрегулация отTrpm6-дефицит.

Телеметрични измервания накръвно налягане, сърдечна честота и двигателна активност. Телеметрични измервания накръвно наляганебяха извършени както следва4.Кръвно наляганетрансдюсери (TAl1PA-C10, Data Sciences International) бяха хирургически поставени в лявата обща каротидна артерия на 2- до 3-месечни мишки под анестезия (чрез интраперитонеално приложение на 0,3 mg/ kg медетомидин, 4 mg/kg мидазолам и 5 mg/kg буторфанол). След 3 седмици възстановяване, систолно и диастолнокръвно наляганестойностите бяха записани с 2-минутно планирано вземане на проби на всеки 60 минути с помощта на софтуер Dataquest ART (Data Sciences International). Записите бяха получени за най-малко пет последователни дни и средните стойности на измерванията, направени по едно и също време всеки ден, бяха определени за всяка мишка и използвани за допълнителни статистически анализи, с изключение на допълнителна фигура 4. Въз основа на Nakamori et al.68, бъбречна денервацията е извършена 2 седмици преди поставянетокръвно наляганепреобразуватели, както следва. Бъбреците бяха изложени чрез коремен разрез и съединителната тъкан около бъбречните съдове беше дисектирана. След това бъбречните съдове се потапят в 95 процента етанол за 2 минути и след това в PBS за 2 минути. Фиктивната операция се извършва с помощта на еквивалентна процедура без потапяне в етанол. Алискирен се прилага 25 mg/kg/ден чрез подкожно вграждане на осмотична помпа (1004, ALZET) и записването започва от деня след въвеждането на помпата. За добавяне на магнезий, мишките бяха хранени с обогатена с магнезий диета, съдържаща 0,6 процента магнезий (CLEA Япония) за 1 месец преди товакръвно наляганеизмерване.

Сърдечната честота беше измерена със същата радиотелеметрична система, с изключение на това, че записът беше извършен с 30-s планирано вземане на проби всяка минута и едно измерване беше използвано за допълнителен анализ.

Локомоторните дейности бяха оценени с помощта на същата радиотелеметрична система, чрез наблюдение на промените в силата на сигнала от трансдюсера, дължащи се на движението на животното. В този случай трансдюсери бяха хирургично поставени в подкожието в десния хълбок. Записите бяха извършени със същите интервали от време, както е описано по-горе.

цистанче бодибилдинг

Препратки

1. Giles, TDC Циркаден ритъм накръвно наляганеи връзката със сърдечносъдовите събития.J. Хипертоници. 24, S11-S16 (2006).

2. Смоленски, MH, Portaluppi, F. & Hermida, RC inКръвно наляганеМониторинг в сърдечно-съдовата медицина и терапията, 3-ти EDT. (eds White, WB) Част II, Ch.6, 105-128 (Springer, 2016).

3. Witteman, JCet al. Проспективно проучване на хранителните фактори и хипертонията сред жените в САЩ. Тираж 80,1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et al. Проспективно проучване на хранителните фактори и хипертонията сред мъжете в САЩ. Тираж 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et al. Проспективно изследване на хранителните фактори,кръвно налягане, и хипертония сред жените в САЩ. Хипертония 27,1065-1072(1996).

Забележка:горното не е пълен списък с референции