Част 2: Дефицитът на DHHC21 отслабва бъбречната дисфункция по време на септично нараняване

Контактtina.xiang@wecistanche.com

Дискусия

В настоящата работа ние докладваме DHHC21 като нов регулатор на бъбречната перфузия и функция по време на септично увреждане. Нашите нови открития показват: (1) Zdhhc21devde? мишките показват по-добра бъбречна функция и по-малко бъбречно увреждане след септично увреждане в сравнение с WT мишки; (2) функционалният дефицит на DHHC21 запазва перфузията на бъбречната тъкан, насищането с кислород и RBF при септично увреждане; (3) DHHC21-катализираното alAR палмитоилиране е необходим за активирането на сигналния път на alAR и индуцираното от alAR свиване на бъбречните артерии. Това проучване предоставя нов механичен поглед върху регулирането на бъбречната перфузия и функция по време на септично увреждане. Предполагаме, че функционалният дефицит на DHHC21 придава защитни ефекти върхубъбречна функцияпри септично увреждане и че инхибирането на DHHC21 може да служи като терапевтична стратегия за борба сбъбречна дисфункцияпо време на септично нараняване.

Щракнете тук, за да разберете ползите от екстракта от Cistanche tubulosa

Хипоперфузията/хипоксията на бъбречната тъкан е една от водещите причини за бъбречна дисфункция по време на септично увреждане3-5. Ние открихме бъбречна хипоперфузия при мишки след CLP, доказана от отслабения интензитет на MSOT сигнала на общия хемоглобин, намалено насищане с кислород в бъбречната тъкан и намален RBF след септично увреждане. В съответствие с нашите констатации, намаляването на RBF е наблюдавано при пациенти със сепсис с бъбречно увреждане, както и при големи животински модели на септично увреждане7,10l1. Заслужава да се отбележи, че няколко проучвания съобщават, че бъбречна дисфункция може да се развие при животни със сепсис с непроменени или дори увеличен RBF334. Тези противоречиви открития могат да се дължат на различни животински модели и методи, използвани за измерване на кръвния поток. Например, докато индуцираното от CLP полимикробно септично увреждане е често използвано, някои проучвания използват интравенозно инжектиране на Escherichia coli35.

Протеиновото палмитоилиране наскоро беше докладвано като нов регулатор на протеиновата функция, участващ в патогенезата и прогресията на много заболявания. За първи път беше идентифициран като нов тип пост-транслационна модификация от Schmidt et al.3637. Откриването на семейството DHHC оттогава насърчи бързото разширяване на това поле38,39. Докладвани са ролите на палмитоилирането и PATs при множество физиологични и патологични състояния, включително липидния метаболизъм,рак, сърдечно-съдови заболяванияи неврологични разстройства23,0,4. Въпреки че участието на палмитоилирането в поликистозно бъбречно заболяване и рак на бъбреците е докладвано по-рано23, има много ограничени проучвания, изследващи функционалната роля на PATs вбъбречни заболявания, по-специално при бъбречна дисфункция по време на септично увреждане. Доколкото ни е известно, ние сме първите, които изследват ролята на DHHC2l в бъбречната дисфункция при септично увреждане. Нашите открития показват, че инхибирането на DHHC21 значително спасява бъбречната функция и запазва структурата на бъбреците при септично увреждане.

Нашето проучване, използващо Zdhhc21dp/d4? мишки показват, че благоприятните ефекти на функционалния дефицит на DHHC21 върху бъбречната функция се приписват на способността му да подобрява перфузията на бъбречната тъкан по време на септично увреждане. При базални условия Zdhhc21ewaeP мишки не показват признаци на дисбаланс сол/вода или бъбречно структурно/функционално увреждане5. Въпреки това, загубата на функция на DHHC21 потиска индуцираното от септично увреждане намаляване на RBF, бъбречната перфузия и бъбречната сатурация с кислород. Повишеното бъбречно съдово съпротивление, причинено от прекомерна бъбречна вазоконстрикция, се счита за основна причина за нарушена перфузия на бъбречната тъкан при септично увреждане6.9. Нашите резултати показват участието на alAR в медиирането на индуцирана от септично увреждане хипоперфузия на бъбречната тъкан, както се вижда от увеличаването на alAR палмитоилирането и активирането на alAR сигнален път при септично увреждане. Въпреки това, функционалният дефицит на DHHC21 инхибира палмитоилирането на alAR и води до притъпена способност на alAR да активира своя ефектор надолу по веригата и да медиира индуцираната от фенилефрин вазоконстрикция в бъбречните артерии.

"Молекулярният механизъм, лежащ в основата на регулирането на функцията на alAR от DHHC21, все още остава да бъде напълно изяснен. Дефектът във функцията на alAR, причинен от загубата на функция на DHHC21, може да се отдаде на конформационната промяна на alAR. Много GPCR разчитат на палмитоилиране за тяхното подходящо вътреклетъчна конформация, прикрепеният палмитат в С-терминалните опашки на GPCR се вмъква в плазмената мембрана, за да създаде четвъртата вътреклетъчна верига, която е от съществено значение за взаимодействието на GPCR с техните партньорски протеини и разпространението на GPCR сигнали 17, 4. Предишно проучване е посочил, че палмитоилирането на Albar също се случва в неговия С-терминален регион 44. Следователно, липсата на DHHC21-медиирано lAR палмитоилиране може да промени вътреклетъчната конформация на alAR, като по този начин блокира разпространението на lAR сигнали. Това може да бъде подкрепено от нашите резултати, показващи, че активирането на ERK, сигнално събитие надолу по веригата на активиране на alAR, се инхибира в Zdhhc21devider мишки, подложени на септ. ic нараняване. Въпреки това, DHHC21-регулираната топология на alAR карбоксилния край трябва да бъде допълнително потвърдена с помощта на рентгенова кристалография.

Друг нов аспект на нашето изследване е използването на MSOT за оценка на бъбречната перфузия и функция по време на септично увреждане. MSOT се съобщава като метод без етикети за измерване на перфузията на различни органи и надеждна техника за изобразяване за определяне на бъбречната функция2832,45. В сравнение с доплеровия флоуметър, който не позволява визуализация на микроваскулатурата45, MSOT генерира изображения с висока пространствена разделителна способност при 150 um, като същевременно осигурява количествена оценка на състоянието на перфузията в бъбречната микроваскулатура. Водоразтворимият IRDye800CW е безопасен индикатор за използване за измерване на бъбречния клирънс и не предизвиква токсичност при доза от 20 mg/kg. Двуфазното движение на IRDye800CW, което наблюдавахме, е в съответствие с публикувани по-рано проучвания. Нашите MSOT записи показват по-голямо забавяне на Tmax при сепсис на бъбреците, което предполага нарушен бъбречен клирънс. Проучване за нефропатия показва, че увредената бъбречна функция, открита от MSOT, е значително свързана с гломерулно хистологично увреждане30. Нашите данни, в съответствие с предишни публикации, предполагат, че MSOT е минимално инвазивна и надеждна техника за наблюдение на бъбречната перфузия и функция.

Понастоящем няма налични DHHC21-специфични инхибитори. Най-често използваният PAT инхибитор е 2-BP, който има широк ефект върху множество DHHCs и също така пречи на метаболизма на мастни киселини47. По този начин разработването на малки молекулни инхибитори, които са насочени конкретно към DHHC21, би било обещаваща посока. Също така си струва да се отбележи, че alAR не е единственият субстрат на DHHC21. Наскоро бяха идентифицирани няколко други субстрата на DHHC21, включително адхезионна молекула на тромбоцитните ендотелни клетки (PFCA M-1), естрогенен рецептор кавеолин-1, ендотелна азотен оксид синтаза (eNOS), Fyn, супероксид дисмутаза (SOD{{ 8}}) и PLCB122, 41, 4s, 49, Въпреки че е извън обхвата на настоящото изследване, не можем да изключим възможността тези субстрати също да повлияят на бъбречната функция по време на септично увреждане.

В заключение, настоящото проучване демонстрира за първи път, че DHHC21 играе критична роля в регулирането на бъбречната перфузия по време на септично увреждане чрез механизми, включващи alAR палмитоилиране и alAR-медиирана вазоконстрикция. Освен това, инхибирането на DHHC21 упражнява защитни ефекти върху бъбречната функция по време на септично увреждане.

Материали и методи

Реактиви. Всички реагенти са изброени в допълнителна таблица S1.

Животни. Zdhhc21depher мишки и техните контролни мишки от див тип (B6C3Fe) са закупени от Jackson Laboratory. Генотипът на Zdhhc21dephe? мишки бяха потвърдени чрез секвениране (Genewiz, Inc., NJ, USA). Праймерите, използвани за секвениране бяха: AGCTGACTGAAGGGCACC (напред) и AAAACCTGTAACGCATTTCCA (обратно)23. Животните са държани при цикъл 12/12-h светлина/тъмнина със свободен достъп до храна и вода. За това изследване са използвани мишки (16-20 седмици) от двата пола. Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на Университета на Южна Флорида и отговарят на ръководството на NIH за грижа и използване на лаборатория

Лигиране и пункция на цекума, Мишките бяха анестезирани с изофлуран (3 процента индукция и 1 процент поддържане). Беше направен среден разрез в обръсната коремна област и цекумът беше екстериоризиран, плътно лигиран на 5 mm под илеоцекалната клапа и перфориран два пъти с 20-игла за измерване дистално от точката на лигиране. Един mm фекалии се екструдират от всеки прободен отвор. След това цекументът беше преместен и коремът беше затворен на два слоя. 37 C лактатен разтвор на Рингер се прилага локално, за да се предотврати изсушаването на цекума. След това на мишките беше даден подкожно физиологичен разтвор с температура 37 градуса 0.9% за реанимация на течности. За аналгезия е дадена предоперативна доза от 0.5-1.5 mg/kg бупренорфин с продължително освобождаване. Фиктивните мишки бяха подложени на същата хирургична процедура, но без лигиране и пункция на цекума 50, 51.

Мултиспектрална оптоакустична томография. Оценка на бъбречната екскреция на IRDye800CW. Мишките бяха анестезирани чрез изофлуран и депилирани около областта на торса. Мишките бяха заснети с помощта на Altera Medical MSOT Imaging System (Мюнхен, Германия) при множество дължини на вълните: 700,730,760,775,785, 800,850 nm при скорост от 10 кадъра/s. Мишките се поставят в легнало положение в държач и се преместват по хоризонталната линейна сцена, за да позиционират бъбреците върху фиксирано позиционирания вдлъбнат трансдюсер. След запис на базовата линия, 60 nmol от RDve800CW, разтворени в 100 ul от 0,9 процента физиологичен разтвор, се инжектират интравенозно за период от 10 s. Изображенията бяха реконструирани с помощта на формулата за обратна проекция и обработени с мултиспектрален анализ. Областите на интерес (ROI) бяха начертани около бъбречната кора и областта на медулата/таза и бяха изобразени временните промени на MSOT сигнала в ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Бъбречна хистопатология. Бъбреците бяха фиксирани, изрязани по сагиталната равнина и обработени за вграждане в парафин. Срезове (5 μm) бяха депарафинизирани, рехидратирани и окислени с периодна киселина за 8 минути при стайна температура (RT), последвано от инкубиране с разтвор на Шиф за 25 минути. След това срезовете се оцветяват обратно с хематоксилин. Изображенията са заснети с помощта на Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, САЩ). Бъбречното структурно увреждане се оценява въз основа на следните признаци: гломерулна аномалия, загуба на четковата граница на проксималния тубул, вакуолизация, дилатация на тубулния епител, отделяне/некроза на тубулни клетки и неутрофилна инфилтрация. Всяка характеристика беше оценена по скала от 0-5 въз основа на тежестта.

Измерване на креатинин и уреен азот в кръвта. Миша кръв се събира чрез сърдечна пункция 24 часа след септично нараняване. Плазмата се генерира чрез центрофугиране на кръвта при 2500 g за 15 минути при RT. Измерване на креатинина: плазмата се депротеинизира с помощта на 10-kDa Spin Column; нивата на креатинин във филтрата след това се измерват с помощта на комплект за анализ на креатинин. Нивото на урейния азот в кръвта (BUN) се определя с помощта на комплект за колориметрично откриване на урейен азот, следвайки инструкциите на производителя.

Измерване на RBF и MAP. Мишките бяха анестезирани с изофлуран. Преобразувателят за кръвно налягане се канюлира в каротидната артерия. Беше направен среден разрез в коремната област, последван от ляв напречен разрез за разкриване на бъбречната артерия. RBF беше измерен с помощта на ултразвуков дебитомер за транзитно време (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). След поставяне на сондата за поток около откритата бъбречна артерия, мишките бяха оставени да бъдат стабилизирани за най-малко 30 минути. RBF и MAP бяха записани едновременно с помощта на PowerLab (AD Instruments, Колорадо Спрингс, Колорадо, САЩ). Данните бяха анализирани с помощта на софтуер LabChart Pro версия 74,55

Улавяне с помощта на смола. Бъбречните артерии се събират и лизират в лизисен буфер (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM палмостатин В, протеазни инхибитори, pH 7,4）22, 56. Тъканните лизати се инкубират с блокиращ буфер (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 процента SDS, 6 ul/ml MMTS, рН 7,4) при 50 градуса С за 30 минути с постоянно завихряне. След утаяване със студен ацетон, протеините се инкубират пелетирани чрез центрофугиране при 5000 g за 30 минути и промити пет пъти със 70 процента студен ацетон Протеиновите пелети бяха ресуспендирани в свързващ буфер (100 mM HEPES, 1,0 процента SDS, 1 mM EDTA, рН 7,4). Всяка протеинова проба се разделя на две равни части, всяка получава същото количество гранули изопропил сефароза 6В, хидроксвламин (0,2 М, рН 7,4) и NaCl (0,2 М), добавени съответно във всяка част След 4 часа инкубиране при RT с постоянно въртене, палмитоилираните протеини се елуират с 50 mM DTT в 1 × буфер за проби и се събират за SDS-PAGE.

Western blotting. Измерване на палмитоилиран lAR. Пробите, събрани от RAC, бяха заредени върху 4-20 процента трис-глицин гел и прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана след електрофореза. След блокиране за 1 час при стайна температура, alAR се изследва със заешко анти-lAR първично антитяло (1:500) за една нощ при 4 градуса. След промиване три пъти с TBST, мембраната се инкубира с IRDye800CW магарешко анти-заешко вторично антитяло (1:20, 000) за 45 минути при RT.

Измерване на ERK фосфорилиране. Бъбречните артерии бяха лизирани в 1 × RIPA, съдържащ протеазни и фосфатазни инхибитори. Мембраната се изследва със заешки анти-ERK(1:1000) и миши анти-фосфорилирани ERK (1:1000) антитела. IRDye800CW магарешки анти-миши антитела и IRDye680RD магарешки анти-заешки антитела бяха използвани за вторична инкубация (1:20 000). Мембраните бяха изобразени и анализирани с помощта на Li-COR Odyssey CLx.

Оценка на вазореактивността чрез жичен миограф. Миши бъбречни артерии. Бъбречните артерии ({{0}} μm в диаметър) бяха изолирани от WT и Zdhhc21dp/de мишки и потопени в ледено студен окислен (95 процента O,/5 процента CO.) физиологичен разтвор на натриев хлорид (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM глюкоза, 0,026 mM EDTA и 1,6 mM CaCl, рН 7,4). Сегменти на съда (~ 2 mm дълги) бяха монтирани върху жичната миографска камера (Living Systems Instrumentation, VT, САЩ) между две волфрамови жици (30 um в диаметър). Изометричното напрежение беше записано с помощта на преобразувател на сигнала Living Systems (MYO-SC-1), съчетан със софтуер LabScribe v4 iWorks. След уравновесяване в продължение на 30 минути при 37 градуса Cin PSS, беше извършена процедурата за нормализиране, за да се определи оптималната вътрешна обиколка L,=0.9×L(Lo=вътрешна обиколка, която съответства на трансмурално налягане от 100 mmHg) . След това, жизнеспособността на съда беше тествана с 60 mMKPSS (74.7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1.18 mM KH, PO.1.17 mM MgSO.7H, O, 14.9 mM NaHCO, 5.5 mM глюкоза, 0.026 mM EDTA, 1.6 mM CaCl, рН 7.4). Артериите, които не реагираха на KPSS, бяха изхвърлени. Артериите бяха третирани с нарастващи концентрации на фенилефрин（10 nM-30 μM）. Ендотелната цялост след това се оценява с помощта на ацетилхолин (10 µM). Построени са кривите концентрация-отговор.

Малки артерии от човешки бъбреци. Малки артерии (~1000 um в диаметър) бяха дисектирани от непокътнати жизнеспособни човешки бъбреци, които бяха отхвърлени за операция за трансплантация. Сегменти на съда (~ 2 mm дълги) бяха монтирани върху I-образните пръти (250 um в диаметър) на телената миографска камера. Подобни процедури за уравновесяване и нормализиране бяха извършени върху човешки артерии. След това артериите се инкубират с контролен носител (0.02 процента DMSO в PSS) в продължение на 1 час. След това съдовете бяха тествани за жизнеспособност с 60 mM KPSS и третирани с нарастващи концентрации на фенилефрин (10 nM-30 uM). След измиване, съдовете се инкубират с 2-BP (100 uM) за 1 час; след това жизнеспособността на съда беше тествана отново с 60 mM KPSS със 100 uM 2-BP. Малките артерии без или с намален отговор на KPSS бяха изхвърлени. След това артериите се предизвикват със същите концентрации на фенилефрин, последван от ацетилхолин (10 uM). Конструират се и се сравняват кривите концентрация-реакция на артериите, третирани с контролен носител или 2-BP.

Имунофлуоресценция. Човешките бъбречни артерии бяха фиксирани в 10 процента формалин за 48 часа, вградени в парафин и нарязани. След това слайдовете бяха депарафинизирани, рехидратирани и пермеабилизирани с PBS, съдържащ 0,05 процента Triton X-1002. След блокиране слайдовете се маркират със заешки анти-DHHC21 и кози анти-1AR антитела (1:100) за една нощ при 4 градуса С. След промиване се извършва инкубация на вторично антитяло с магарешки анти-заешки Alexa Fluor 488 и магарешки анти-кози Alexa Флуор 568 (1:500). След монтиране с монтажна среда ProLong Diamond с DAPI, предметните стъкла бяха изобразени със спектрално обърнат лазерно сканиращ конфокален микроскоп Leica SP8.

Статистически анализ. Подробна информация (напр. име на теста, post-hoc тест, n стойност, алфа ниво, p-стойност) за всеки статистически тест е посочена в допълнителна таблица S2. Всички данни отговарят на предположението за нормално разпределение. Тестът за нормалност беше извършен с помощта на теста на Shapiro-Wilk с алфа ниво, зададено на 0.05. Сравненията между две групи бяха анализирани с помощта на t-тест на Student (двустранен) и три или повече групи бяха сравнени чрез еднопосочен ANOVA с пост-хок анализ на Tukey. Сравнението за кривите на телената миография беше извършено с помощта на двупосочна ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">