Физическото обучение инхибира образуването на фиброза при болестта на Алцхаймер. Бъбречно повлияване на сигналните пътища на TGFB

edmund.chen@wecistanche.com

ВЪВЕДЕНИЕ 

Болестта на Алцхаймер (БА) е най-честата форма на деменция, но за нейната системна поява започва да се говори едва през последните десетилетия. Въпреки че са положени големи усилия за разработване на лекарства и терапии, модифициращи заболяването, към днешна дата няма налични лечебни процедури [1–3]. Образуването на амилоидни плаки и анормалната функция на прекурсорите на амилоидния протеин (АРР) се считат за първи признаци на заболяването не само в централната нервна система (ЦНС), но и в периферията [4]. Убедителни доказателства подкрепят основната роля на амилоид-B (AB) в патогенезата на AD [5], като посочват, че намаленият клирънс на AB е един от ключовите процеси в патомеханизма. При AD са включени няколко периферни органа като тестис [5], панкреас [6] ибъбрек[7], подчертавайки развитието на комплексно системно заболяване с множество цели [8]. Доказано е, чебъбрекучаства в клирънса на АБ [9]. Освен това, серумната концентрация на АВ е значително повишена при хроничнизаболяване на бъбреците (CKD) пациенти [10, 11]. Натрупването на AB също е доказано вбъбрек[12], което води до нарушение на филтрацията. Правилната филтрация се регулира частично от трансформиращия растежен фактор B (TGFB), който е главен цитокин в патогенезата набъбречнавъзпаление и фиброза [13] и също така е известен като важен фактор в патогенезата на AD [14]. При AD, TGFB сигнализирането играе роля в микроглиалното активиране и астроцит-медиираната невропротекция [15]. Освен това, променената експресия на TGFB също засяга възпалението в ЦНС и периферните тъкани [13, 16].

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ

TGFB има три изоформи: TGFB1, TGFB2 и TGFB3 [17]. TGFB1 участва в няколко процеса като развитие на плода, контрол на клетъчния растеж и диференциация, фиброза и образуване на белези, туморен растеж и имунен отговор [18]. Той е важен цитокин при образуването на фиброза в различни органи като черния дроб ибъбрек[19]. TGFB1 образува димери, които първо се свързват с TGFB рецептор тип II (TGFRII), след това активират TGFB рецептор тип I (TGFRI) Ser/Thr киназа, инициирайки вътреклетъчно сигнализиращо комплексно образуване на Smad транскрипционни фактори. В каноничния TGFB сигнален път, Smad2/3 транскрипционните фактори се фосфорилират и след образуване на комплекс със Smad4 се преместват в ядрото [20]. Няколко гена могат да бъдат повлияни от активирането на TGFB1, тъй като индуцира експресията на различни колагени, контролира клетъчната пролиферация, повлиява апоптозата [20] и регулира експресията на матриксната металопротеиназа (MMP) [21]. Неканоничният сигнален път на TGFB инициира активирането на MAPKes чрез фосфорилиране, което от своя страна може да индуцира допълнителна експресия на TGFB [22]. JNK и p38 киназите като TGFB мишени са идентифицирани вбъбречнафиброза и регулират апоптозата [23].

Доказано е, че физическата активност има благоприятен ефект при хора. Упражненията могат да регулират и отложат проявата на AD [24, 25] и също се съобщава за намаляване на биомаркерите на AD като тау и AB в плазмата [25]. Установено е, че физическата активност намалява честотата на AD, свързаната с AD невропатологична тежест и когнитивен спад [26]. Въпреки че са публикувани множество проучвания за ползите от физическата активност върху формирането на AD [27], вътреклетъчните механизми, включени в тези положителни ефекти, не са обсъдени подробно. Има няколко животински модела, при които генетично модифицирани мишки със свръхекспресия на тау и AB са тествани по време на физически упражнения. В тези модели е доказано, че повишената физическа активност е в състояние да отложи изявата на AD [28, 29]. Освен това беше доказано, че дългосрочното обучение на тези мишки има положителен ефект върху дисфункциите на периферните органи при AD. Физическата активност промени PACAP-BMP пресичането в ADбъбрецичрез нормализиране на експресията на натрупване на колаген тип IV и А [30]. Освен това е публикуван подробен анализ на защитната функция на обучението върху експресията на Sox9 в тестисите на AD [31]. Активното обучение също засяга сигнализирането на TGFB, тъй като потискабъбречнавъзпаление и последваща фиброза [32]. В допълнение, TGFB и неговото сигнализиране са важни за костното ремоделиране на възрастни, което е нарушено вбъбрекфиброза [33]. Впоследствие нашата основна хипотеза беше, че дългосрочното физическо обучение има системен ефект върху сигнализирането на TGFB, което може да регулирабъбрекпроизводство на матрици в AD. Промените на тези сигнални пътища могат да доведат до намаляване бъбрекфиброза и нормализиране на клирънса на AD. Следователно, нашата цел беше да изясним връзката между TGFB-сигнализиране и полезните ефекти на физическото обучение върхубъбрекфиброза при AD. В нашите експерименти представяме доказателства, че дългосрочното обучение има пряк ефект върху сигнализирането на TGFB вбъбрецина AD мишки. Освен това показваме, че увеличените физически упражнения намаляватбъбрекфиброза чрез нормализиране на канонична и неканонична TGFB сигнализация.

Ключови думи:Болест на Алцхаймер, фиброза, физическа активност, Smad, бъбречно заболяване; бъбречна

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ДИАЛИЗА

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

ЖивотноМъжки алцхаймер-трансгенни (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) мишки бяха използвани за проследяване на ефекта от AD. Тримесечен див тип (WT) (без трансгенна модулация и без обучение) (n=5), трансгенни мишки на Алцхаймер (AD) (n=5) и обучени AD (TAD) (n=5) мишките се държат при цикли светлина/тъмнина от 12/12 часа с храна и вода ad libitum. Интервално бягане на бягаща пътека беше приложено за упражнения и комбинирана група. Преди това всички трениращи животни бяха привиквани с моторно задвижваната бягаща пътека (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) и скоростта на бягане в продължение на 2 седмици. Обучението се провежда четири пъти седмично по 60 минути. Всяка тренировъчна сесия продължи 10 цикъла, всеки цикъл се състоеше от 4 минути бягане с висока интензивност и 2 минути бягане с ниска интензивност. Скоростта на бягане с ниска интензивност е постоянна по време на експеримента, което означава скорост от 10 м/мин. Докато скоростта на бягане с висока интензивност започва от 16 m/min и се повишава всяка трета седмица с 1 m/min, докато се достигне 20 m/min. Контролната и хранителната група също бяха привикнали към бягащата пътека и оставаха там за 5 минути/ден на стояща бягаща пътека [28]. Експериментите са започнати с 3-месечни животни и са прекратени на 10-месечна възраст. Проучването е проведено в съответствие с етичните насоки (номер на етично разрешение за това проучване: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweis University, Унгария). Phire Animal Tissue Direct PCR Kit беше използван за генотипизиране на животните (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) съгласно инструкциите на производителя.

Светлинна микроскопска морфологияСлед приключване на всички когнитивни тестове, {{0}} месечни мишки бяха анестезирани с интраперитонеална инжекция на кетамин (Рихтер, концентрация: 100 mg/ml)/ксилазин (Produlab Pharma, концентрация: 20 mg/ ml) коктейл в доза от 0,1 ml/10 g телесно тегло и транскардиално перфузиран с хепаринизиран леденостуден физиологичен разтвор [28] ибъбрецибяха премахнати. Тъканните проби се промиват в PBS три пъти и се фиксират в смес 4:1 от абсолютен етанол и 40 процента формалдехид, след което се поставят в парафин. За трихромното оцветяване на Masson (Sigma-Aldrich, MO, USA) бяха направени серийни срезове и беше визуализирана фиброзната тъкан. Протоколът за оцветяване се провежда съгласно инструкциите на производителя. Камера DP74 (Olympus Corporation, Токио, Япония) на микроскоп Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Токио, Япония) беше използвана за правене на фотомикрографии.

Имунохистохимияе извършено набъбректъканни проби от WT, AD мишки и TAD мишки за визуализиране на локализацията на Smad2, PCNA (пролифериращ клетъчен ядрен антиген) и колаген тип I (Col. I) [30].Бъбрецисе фиксират в 4:1 смес от абсолютен етанол и 40 процента формалдехид и се промиват в 70 процента етанол. След като бяха направени серийни срезове, депарафинизацията беше последвана от изплакване в PBS (рН 7.4). Неспецифичните места на свързване бяха блокирани с 1% говежди серумен албумин, разтворен в PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Срезовете се инкубират с поликлонален Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) при разреждане 1:500, PCNA (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) при разреждане 1:800 или Col. I (Sigma-Aldrich, MO, USA) антитяло при разреждане 1:500 при 4 °C за една нощ. Първичните антитела се визуализират с добавяне на анти-заешко Alexa Fluor 555 вторично антитяло (Life Technologies Corporation, Карлсбад, Калифорния, САЩ) се използва при разреждане 1:1000. Пробите бяха монтирани в монтажна среда Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, Англия), съдържаща DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дихидрохлорид) за оцветяване на ядрена ДНК. Анти-заешки Alexa Fluor 555 беше използван без първичните антитела за отрицателна контрола. Микрофотографии са направени с помощта на камера DP74 (Olympus Corporation, Токио, Япония) на микроскоп Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Токио, Япония) за визуализация на полковник I. Изображенията са получени с помощта на софтуер cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Токио, Япония ) с постоянни настройки на камерата, за да се позволи сравнение на интензитета на FL флуоресцентния сигнал. За откриване на Smad2 и PCNA беше използван конфокален микроскоп Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokyo, Япония) с прилагане на маслен имерсионен обектив 60 × (NA: 1.42). За възбуждане са използвани лазерни линии от 543 nm. Средното време на пикселите беше 4Bs. Серията Z изображения с оптична дебелина 1 m беше записана в режим на последователно сканиране. Изображенията на Alexa555 и DAPI бяха насложени с помощта на софтуера Adobe Photoshop версия 10.0. Контрастът на изображенията беше еднакво увеличен, без да се променят постоянните настройки.

RT-PCR анализБъбрециот WT (n=5), AD (n=5) и TAD (n=5) бяха механично смлени и бяха разтворени в Trizol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ), след 30 минути инкубация при 4 ° C и общата РНК беше изолирана [30]. РНК се събира във вода без РНКаза и се съхранява при –70 ◦C. Използван е RT комплект с голям капацитет за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, САЩ). За последователностите на приложените двойки праймери и подробности за полимеразните верижни реакции вижте Таблица 1. Амплификациите бяха извършени в термичен цикъл (Labnet MultiGene™ 96-ямков градиентен термичен циклер; Labnet International, Edison, NJ, USA) като следва: 95°C, 2 минути, последвани от 35 цикъла (денатурация, 94°C, 30 s, отгряване за 45 s при оптимизирани температури, както е дадено в таблица 1; удължаване, 72°C, 90 s) и след това 72°C ,

7 мин. Актинът се използва като вътрешен контрол. PCR продуктите бяха анализирани с помощта на 1.2% агарозен гел, съдържащ етидиев бромид и документирани с FluorchemE geldocumetary system (ProteinSimple, СА, САЩ). Оптичните плътности на PCR продуктовите сигнали се определят чрез използване на безплатен софтуер ImageJ 1.40 g. Преди измерванията на оптичната плътност направихме индивидуални калибрации на всяка микрофотография. След това увеличихме увеличението на снимките, за да достигнем индивидуален размер на пиксела и с метода на свободната ръка лентите бяха прецизно оградени и измерена интегрираната плътност на зоната. Пикселите са измерени в 5 независими експеримента от 3 независими оператора. Сигналите първо бяха сравнени с WT актин за по-добро сравнение на разликите в експресията при AD и TAD мишки. Числата под лентите показват статистическия анализ на експериментите, където всеки отделен експеримент (най-малко 5) е нормализиран за собствен актинов сигнал и след това са изчислени статистически разлики.

Western blot анализ

Бъбрециот WT (n {{0}}), AD (n=5) и TAD мишки (n=5) се промиват във физиологичен разтвор N и се съхраняват при –7{{1 0}}◦C. Пробите се смилат механично в течен азот и се събират в 100 ml хомогенизиращ RIPA (радиоимунопреципитационен анализ) буфер (150 mM натриев хлорид; 1,0 процента NP40, 0,5 процента натриев дезоксихолат; 50 mMTris, рН 8,0), съдържащ протеазни инхибитори (апротинин ( 10 g/mL), 5 mM бензамидин, леупептин (10 ug/mL), трипсин инхибитор (10 g/mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluoride, 1 mM Na-ортованадат). Пелетите бяха обработени с ултразвук чрез импулсен взрив за 30 s при 40 A (ColeParmer, IL, USA). Бяха приготвени общи клетъчни лизати за Westernblot анализи [30]. 20 g протеин се отделят в 7,5 процента SDS-полиакриламидни гелове за откриване на TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, разцепена каспаза3, MMP9, колаген тип I (Col. I) и актин. Комплект за откриване на PhosphoSer/Thr (Millipore, Billerica, MA, USA) се използва за откриване на нивото на фосфорилиране на страничните вериги на аминокиселини Ser/Thr. Протеините се блотират върху нитроцелулозни мембрани и се излагат на първичните антитела за една нощ при 4°C в разреждането, както е дадено в Таблица 2. Инкубацията се последва от 30 минути PBST промиване, след което мембраните се покриват с пероксидаза-конюгирано вторично антитяло антизаешки IgG в 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, САЩ) или анти-миши IgG в разреждане 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, Калифорния, САЩ). За откриване се използва усилена хемилуминесценция (Advansta Inc., Menlo Park, СА, САЩ) съгласно инструкциите на производителя. Актинът се използва като вътрешен контрол. Сигналите бяха заснети с охладена камера на гел документална система (Fluorchem E, ProteinSimple, Калифорния, САЩ). Оптичните плътности на сигналите бяха измерени с помощта на безплатен софтуер ImageJ 1.40g. Преди измерванията на оптичната плътност направихме индивидуални калибрации на всяка микрофотография. След това увеличихме увеличението на снимките, за да достигнем индивидуален размер на пиксела и с метода на свободната ръка лентите бяха прецизно оградени и измерена интегрираната плътност на зоната. Пикселите са измерени в 5 независими експеримента от 3 независими оператора. Сигналите първо бяха сравнени с WT актин за по-добро сравнение на разликите в експресията в AD и TAD. Числата под лентите показват статистическия анализ на експериментите, при които всеки отделен експеримент (най-малко 5) е нормализиран към собствен актинов сигнал и след това са изчислени статистически разлики.

Статистически анализВсички данни са представителни за поне пет независими експеримента. За всички фигури, пробите от едни и същи WT, AD и TAD животни бяха избрани с тяхната вътрешна контрола за по-добро сравнение. Във всяка фигура е използвана само една демонстративна снимка от една и съща група животни. Статистическият анализ беше извършен чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA), последван от пост-хок теста на Tukey HSD. Прагът за статистически значими разлики в сравнение с контролните проби беше зададен на ∗p < 0.05="" и="" на="" ad="" проби="" #p="">< 0,05.="" ∗="" показва="" разликите="" wt="" в="" сравнение="" с="" ad="" и="" tad,="" #="" показва="" разликите="" ad="" в="" сравнение="" с="">

РЕЗУЛТАТИ

Физическата активност нормализира каноничния TGF сигнален път в бъбреците на AD мишкиЕкспресията на елементите на каноничния сигнален път на TGFB беше изследвана подробно. Експресията на протеин и иРНК на TGFB1 не показва значителна разлика, когатобъбрецина WT и AD мишки бяха сравнени, но повишената експресия беше открита в TAD проби (фиг. 1A, B). Експресията на TGFRI намалява при AD, но физическата активност я нормализира (фиг. 1A, B), докато експресията на TGFBRII се повишава прибъбрецина AD мишки, но намалява след физическа активност (фиг. 1A, B). В съответствие с тези наблюдения, експресията на Smad2 се увеличава в пробите на AD и се нормализира след физическоактивност (фиг. 1A, B). Напротив, експресията на Smad3 показва умерено намаление набъбрецина AD мишки, който е компенсиран в TAD проби (фиг. 1A, B). Повишаване на Smad2 положителните сигнали се наблюдава в тубулната система на кората, но не и вбъбречнателца в AD мишки. Това повишение е намалено в тубулите на TAD животни (фиг. 1C).

Неканоничните сигнални пътища са модифицирани в бъбреците на AD мишки след физическа активностMAPK-es, като ERK, p38 и JNK, формират важна част от неканоничното TGF сигнализиране [22]. Експресията на mRNA на ERK не е промененабъбрецина AD мишки, но показва намаление в TAD пробите (фиг. 2А). Експресията на протеин на тази киназа не е в корелация с експресията на иРНК и е установено силно намаление вбъбрецина AD мишки с умерено нормализиране след повишена физическа активност (фиг. 2B). Активната, фосфорилирана форма беше интересно повишена в пробите на AD и показа подобно понижение набъбрецина TAD мишки (фиг. 2В). Експресията на иРНК на р38 не се променя значително в нито една от пробите (Фиг. 2А). Експресията на протеин на p38 силно се увеличава вбъбрецина AD мишки, което е частично компенсирано от физическа активност (фиг. 2B). Интересното е, че по-активната фосфорилирана форма показва намаляване на AD пробите, което

се нормализира при TAD животни (фиг. 2В). mRNA експресията на JNK беше намалена както в AD, така и в TAD проби (Фиг. 2А). Протеиновата експресия на 2-те изоформи на JNK се открива чрез Western blot анализ. Разкрити са неизлишни функции за JNK1 и JNK2 [34] и е открито значително намаляване на 57 kDa изоформа и 46 kDa изоформа в AD проби (Фиг. 2B). Изоформите 57 kDa и 46 kDa показват повишение след физическа активност вбъбрецина TAD мишки (фиг. 2В).

Променена експресия на Ser/Thr фосфатази и модифицирано протеиново фосфорилиране при ADПроменена Ser/Thr специфична експресия и функция на протеинова фосфатаза е демонстрирана при AD [35, 36]. Открихме повишена експресия на PP2B вбъбрецина AD мишки, но е намалено от физическа активност (фиг. 2A, B). Напротив, експресията на другата основна клетъчна Ser/Thr специфична фосфатаза, PP2A, се появява със силно намаление набъбрецина AD мишки (фиг. 2A, B). В TAD пробите, тРНК и протеиновата експресия на РР2А каталитична субединица се повишава (фиг. 2А, В). Изследването на протеиновото фосфорилиране върху Ser/Thr остатъци показва силен сигнал при 55 kDa вбъбрецина AD мишки, представляващи молекулното тегло на тау (фиг. 2C). Друга повишена ивица се появява при 10 kDa, което съответства на молекулното тегло на разцепения С-терминал на АРР (фиг. 2С). Фосфорилирането и на двата протеина е намалено при упражняване (фиг. 2C).

TGF сигнализирането повлиява клетъчния цикъл и апоптозатаКато маркери за клетъчна пролиферация се наблюдават нивата на експресия на p21 и PCNA. Известно е, че активирането на TGFB индуцира експресията на p21 [37]. Освен това, активирането на TGFB1 води до променена клетъчна пролиферация [38]. Следователно беше изследвана експресията на пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA). Нивото на протеин на p21 е значително повишено при AD, но е намалено в TAD проби (Фиг. 3A, B). PCNA реагира по различен начин: AD причинява намаляване на протеиновата експресия, докато PCNA протеинът се увеличава при упражнения (фиг. 3A, B). Беше проведена имунохистохимия за идентифициране на PCNA положителни клетки и доведе до намалена имунореактивност в тубулни клетки в бъбреците на AD мишки. Интересно е, че нормализирана PCNA позитивност е показана в тубулните клетки на TAD мишки. Не бяха открити PCNA положителни клеткибъбречнакорпускули (фиг. 3C). Тъй като сигнализирането на TGF1 може да повлияе на апоптозата [39], беше изследвана активната форма на проапоптозната каспаза3. Въпреки че в WT проби беше открита лека иРНК експресия на каспаза3, не беше показана разцепена, активна капаза3. Напротив, силна иРНК и разцепена каспаза3 се появяват в пробите на AD, докато повишената физическа активност намалява експресията на проапоптотичния протеин (фиг. 3A, B).

Бъбречната фиброза се регулира надолу чрез физическа активностПредишни резултати показват възможна фиброза в бъбреците на AD животни. Първо, беше изследвана експресията на MMP9, която може да се регулира чрез активиране на TGFB1 [21]. mRNA на MMP9 се експресира във всички проби, но показва значително увеличение само в бъбреците на TAD мишки. Експресията на протеин на матриксната металопротеиназа беше на границата на откриване в WT проби, но показа значително повишение при животни с AD. Изненадващо, активните физически упражнения драстично повишават експресията на MMP9 (фиг. 4A, B). Другият компонент на фиброзните процеси е повишеното отлагане на колаген тип I вбъбрек[40]. В WT проби беше открита ниска иРНК и протеинова експресия на колаген тип I, но силно увеличение беше показано при AD животни. Активното физическо движение нормализира както иРНК, така и протеиновата експресия на колаген тип I (фиг. 4A, B). Колаген тип I обикновено обгражда тубулите и е локализиран също в интерстициума. При рутинно патохистологично оцветяване на трихрома на Masson, синият цвят представлява наличието на всякакъв вид колаген, който се вижда около тубулите,бъбречнателца и малко количество в интерстициума при WT бъбреците. В проби от AD се наблюдава силно натрупване в интерстициума и в някои тубули. След физическа активност количеството на колаген е намалено и не се открива натрупване в интерстициума (фиг. 4C). Извършена е имунохистохимия на колаген тип I, за да се определи натрупаният колаген. В WTбъбреци, подобно на оцветяването на Masson, се появяват сигнали около тубулите,бъбречнасъщо се виждат телца и слаб интерстициален сигнал. В проби от AD мишки е показана силна имунопозитивност в интерстициума и около тубулната система. Изненадващо, намалението беше видимо в интерстициалната тъкан, но значителен сигнал се появи в апикалната част на тубулните епителни клетки при TAD животни (фиг. 4D).

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА

ДИСКУСИЯ

Въпреки че процесът на образуване на AD се обсъжда широко в ЦНС, промените и възможните периферни съпътстващи патологии не се изследват подробно. Основната ни хипотеза беше тазибъбрекфиброзата е възможен процес, който засяга проявата на AD и натрупването на A. От друга страна, дългосрочното физическо обучение има положителен ефект върху AD, което може да има корелация със системната промяна на сигналния път на TGFB. Доказано е, че периферните органи участват в патогенезата на AD, като между другото е открита променена метаболитна ензимна активност при пациенти с AD [41] и е показано натрупване в панкреаса [42] и вбъбрек[30]. Това системно заболяване, засягащо различни органи, затруднява ранната диагностика и лечение на AD. Клирънсът на AD от ЦНС се регулира частично от астроцити и микроглия, но известна част след преминаване през кръвно-мозъчната бариера може да бъде отстранена в периферията [43]. Този периферен клирънс се счита за една от възможните лекарствени цели за намаляване на концентрацията на AD в плазмата [44]. Секрецията на малки молекули от проксималните тубули на бъбреците представлява жизненоважна хомеостатична функция и може да участва в секрецията на токсини или протеини в урината [45]. Доказано е, че AD се секретира в урината и може да бъде диагностичен признак на деменция [46]; освен това, бъбречната дисфункция при възрастните хора може да повиши риска от деменция [47] и беше установено, че серумните нива на AD са значително по-високи при пациенти с ХБН [10]. Тези данни показват възможна функция набъбрекпри AD клирънс в периферията. Доказано е, че физическите упражнения имат положителен ефект върху бъбречната функция, тъй като запазват правилната гломерулна морфология и защитават тубулната секреция [48]. Доказано е, че повишената физическа активност намалява сигнализирането на TGFB в бъбреците и физическите упражнения могат да бъдат добра антифибротична стратегия [32]. Като цяло, активирането на TGF може да има пряка връзка със сигнализирането, свързано с физическата активност, което може да поддържа клирънса на AD в периферията. Следователно, ние изследвахме TGFB сигналния път в WT, AD и дългосрочно обучени AD мишки.

В настоящото проучване беше доказано, че експресията на TGFFRII е повишена в бъбреците на AD мишки и частично нормализирана в TAD проби. Повишеният TGFBRII показва засилено активиране на сигналния път на TGFB при AD [49]. Намалената експресия на TGF RI показва, че TGF се свързва с по-висок афинитет към TGFBRII и образуването на хомодимер е вероятно при AD [50]. Подобно на тези резултати, образуването на TGFFRII хомодимер е показано в макрофагите вбъбречнафиброза [51]. От друга страна, дългосрочното обучение изравнява експресията на TGFB рецепторите, което предполага образуване на хетеродимерен рецепторен комплекс, който може да бъде стабилизиран от повишената експресия на TGFB1 [50]. Освен това експресията на Smad2 и Smad3 беше променена противоречиво в AD. Известно е, че Smad2 се активира класически от TGF рецептори и се премества в ядрото, докато Smad3 има отделна функция [52]. Публикувано е, че понижената регулация на Smad3 засяга фиброзата [53]. Нормализираната експресия на Smad транскрипционни фактори в TAD проби показва

че физическата активност ребалансира TGFB сигнализирането и намалява неговото патобиохимично активиране. Семейството митоген-активирана протеин киназа (MAPK), съдържащо p38MAPK, JNK и ERK, има взаимодействие с TGF сигнализация [54]. Повишената експресия на р38 е показана в тубулни епителни клетки, предизвикващи бъбречна фиброза и нейното блокиране може да бъде добра цел за лечение на фиброза [55]. При AD мишки беше открита повишена експресия на р38 протеин, което допълнително поддържа образуването на фиброза. Напротив, фосфорилирането на p38 е намалено в бъбреците с AD, което показва зависимо от етапа на фиброза активиране на p38 MAPK [56]. От друга страна, повишената физическа активност частично нормализира както p38, така и фосфорилираната форма, присъстваща в бъбрека, което предполага балансираща функция на обучението при p38-медиирано образуване на фиброза. Подобно на р38 киназата, инхибирането на JNK може да потисне образуването на фиброза [57]. JNK активирането има различни функции в различни части на бъбрека, като гломерулна филтрация и интерстициални фиброзни процеси [58]. Протеиновият екстракт в нашите експерименти, получен от общия бъбречен лизат, показва, че по време на развитието на AD JNK вероятно има различна функция в тубулните и гломерулните части с клетъчно-специфично изотипно активиране в бъбреците, засегнати от AD. Съобщава се за индуцирано от TGFB1 MMP активиране в зависимост от функцията на p38 [59], докато инхибирането на активността на ERK намалява интерстициалната фиброза [60]. Тези данни силно подкрепят различни функции на членовете на семейството MAPK в патогенезата на бъбречната фиброза при AD. Открихме ниска експресия на ERK в бъбреците на AD мишки, докато количеството на неговата фосфорилирана, активна форма е значително повишено. В експерименталната група мишки, участващи в дългосрочно физическо обучение, открихме нормализирана експресия на ERK и фосфо-ERK и благоприятен ефект върхубъбречна функция.Тези наблюдения подкрепят приноса на ERK във фиброзната трансформация на бъбреците при AD и демонстрират изненадващо очевидно положително влияние на физическото обучение върху бъбречната морфология и функция на AD мишки. Наскоро нашата лаборатория доказа участието на ERK в механотрансдукцията на развиващите се хрущялни клетки [61].

Фосфорилирането на TGFBRII, Smad, JNK, p38 и ERK се появява върху остатъци Ser [62], което предполага възможно активиране на Ser/Thr фосфатази. Дисрегулация на PP2B е доказана при AD [35, 63]. От друга страна, PP2B не регулира значително фосфорилирането на тау в мозъка, въпреки че е в състояние да го дефосфорилира на няколко места за фосфорилиране [35]. Другата основна клетъчна Ser/Thr фосфатаза, PP2A също дефосфорилира протеини върху Ser остатъци и нейната активност е намалена при AD и е в състояние да регулира тау фосфорилирането с по-висок афинитет от PP2B [64]. Беше демонстрирана намалена PP2A, но повишена експресия на PP2B в бъбреците на AD мишки, подобно на CNS. Повишеното фосфорилиране на Ser остатъци, в резултат на намаляване на експресията на PP2A, може да индуцира хиперфосфорилиране на тау протеин или АРР, както беше предсказано в бъбреците на AD мишки. Дефосфорилирането на JNK и p38 може да бъде директно регулирано от PP2B [65], следователно намаленото активиране на тези кинази при AD може да бъде следствие от повишена експресия на PP2B. От друга страна, дефосфорилирането на ERK киназата може да се случи предимно чрез активиране на PP2A [66], впоследствие намалената експресия на PP2A може да доведе до повишено фосфорилиране на ERK при AD. Дългосрочното обучение на AD мишки действа към нормализиране на експресията на PP2B и PP2A, което от своя страна изглежда измества нивото на фосфорилиране Ser/Thr на MAPK ензимите по-близо до нормалното. Механичното натоварване упражнява балансиращ ефект върху обратимото фосфорилиране чрез участието на PP2B и PP2A също и в диференциращите хондроцити [61].

Активирането на неканоничния TGFB сигнален път регулира клетъчната пролиферация и апоптоза. Подобно на нашите резултати, p21 положителни клетки са показани в тубулната система на бъбрека [67] и ние също демонстрирахме тяхната повишена експресия при AD. Това повишение предполага спиране на клетъчния цикъл при AD, медиирано от MAPK активиране, докато p21 взаимодейства с PCNA и блокира клетките в S-фазата на клетъчния цикъл [68]. Открихме активиране на р21 и вероятно последващо силно намаляване на PCNA в тубулната система на AD мишки. Подобно на предишните ни открития, повишената физическа активност нормализира клетъчния цикъл в клетките на тубулната система. От друга страна, p21 също има връзка с активирането на каспаза и JNK, докато ERK също индуцира разцепване на каспаза3 [69, 70]. Установено е, че активирането на каспаза3 играе важна роля в патогенезата на AD чрез натрупване на A и предизвикани от каспаза разцепване-индуцирани от разцепване синоптични разстройства [71]. В бъбреците на AD мишки открихме високо разцепени експресии на каспаза 3, показващи повишена апоптоза и загуба на функция на тубулни и гломерулни клетки. Тези процеси могат да насърчат натрупването на AD в бъбречния интерстициум, както показахме по-рано [30].

CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ

Доказано е, че медиираната от TGFB сигнализация повишава експресията на колаген и натрупването му в интерстициума [40]. Според тези резултати в бъбреците на мишки с AD, ние демонстрирахме значително повишена експресия на колаген тип I, натрупана в интерстициума. Тези данни категорично предполагат, че променената канонична и неканонична TGFB сигнализация при AD играе решаваща роля в бъбречната фиброза [18, 72]. Напротив, дългосрочното обучение намалява локализацията на интерстициалния колаген тип I поне частично чрез повторно балансиране на сигнализацията на TGFB. Намалената фиброза може да предизвика клирънс на AD и да го намалибъбречнанатрупване, както показахме по-рано [30]. Тази хипотеза беше подкрепена от нашите открития, тъй като физическото обучение доведе до натрупване на колаген тип I в тубулни епителни клетки, което беше демонстрирано в бъбреците на TAD мишки, което предполага процеса на разграждане на колаген. MMP9 може да се активира чрез TGFB сигнализиране в бъбрека [73] и води до разграждане на матричните фибрили. Въпреки че ММР имат както инхибиторна, така и стимулираща роля във фиброзата, ММР9 се счита за профибротичен агент, медииран от активиране на TGFB [74]. Напротив, доказано е, че ММР9 може да играе регулаторна роля в разграждането на колаген тип I в бъбреците [75]. В бъбреците на AD мишки, ние показахме повишена експресия на MMP9, което предполага неговата функция във фиброзния процес, контролиран от TGFB сигнална каскада. От друга страна, допълнително повишение беше измерено след дългосрочно обучение, което може да е причина за силното намаляване на експресията и тубуларния вид на колаген тип I. При механичен стимул нашата лаборатория показа, че експресията на MMP9 е повишена в първичните хондрогенни култури [76] и подобни резултати са публикувани при образуването на тъкан на белег, където механичната компресия повишава експресията на MMP9 [77]. При остро бъбречно увреждане повишаването на MMP9 има антиапоптотична функция и защитава S3 частта на проксималните тубули [78]. Освен това, в белите дробове също е открит сигнален път на TGFB, активиран от стрес на срязване, и намалено образуване на фиброза [79]. Освен това, механичният стрес в белодробните епителни клетки индуцира ремоделирането на ECM чрез активиране на MMP9 и променя експресията на колаген [80]. Следователно можем да заключим, че повишената физическа активност индуцира ремоделирането на производството на матрица чрез модулиране на TGFB сигнализация не само локално, но и системно. Ограниченията на нашата работа са, че трансгенните мишки могат да имат по-бързо образуване на AD и бъбречната функция не е изследвана подробно. Трябва да се проучи допълнително, че само производството на матрица, индуцирано от TGFB, се променя във фиброзни бъбреци на AD мишки или регулирането на баланса на натрий и калий и изчистването на AD също участва в дългосрочно обучение. В допълнение, натрупването на колаген тип I в урината също може да бъде проследено допълнително, за да се подобри, че дългосрочното физическо обучение при AD води до намаляване на бъбречната фиброза. От друга страна, ние доказахме in vivo, че дългосрочното физическо обучение има системен ефект върху каноничното и неканоничното TGFB сигнализиране. In vivo демонстрирахме, че физическото обучение намалява образуването на бъбречна фиброза при AD, което има положителен ефект върху проявата на заболяването. В заключение, нашите данни предполагат, че активирането на сигналните пътища на TGFB играе причинно-следствена роля във фиброзната трансформация на бъбреците на AD мишки. Като много прост подход за постигане на положителни промени в това състояние, ние препоръчваме дългосрочно физическо обучение, тъй като то успя да нормализира експресията и фосфорилирането на членовете на каноничните и неканоничните TGFB сигнални пътища и доведе до подобряване на бъбречната фиброза. Освен това, физическите упражнения, които инхибират фиброзата, могат да балансират отново бъбречната функция и могат да предизвикат повишен клирънс на системния AD при AD.