Положителна корелация между сплескване на бъбречните тубули и увреждане на бъбречните тубули/интерстициална фиброза при модели на миши бъбречни заболявания
Mar 17, 2022
РЕЗЮМЕ.Броят на пациентите с хронични заболяване на бъбреците(CKD) нараства непрекъснато в световен мащаб. За да се изследват патогенезата и механизмите, са разработени много животински модели, включително спонтанни, генетични и индуцирани модели. Въпреки че всеки тип ХБН показва специфични за заболяването тъканни промени в ранните етапи, тубулното разстройство и интерстициалната фиброза се появяват хистологично в хода на прогресията до краен стадийбъбречна недостатъчност. Следователно, количественото определяне на тубулното разстройство и интерстициалната фиброза при изследване на ХБН с помощта на животински модели е от съществено значение за измерване на степента на тежест на ХБН и следователно ефикасността на терапевтичните средства. Използвани са няколко стратегии за количествено определяне на интерстициалната фиброза. Сред факторите за точкуване,бъбречнатръбното сплескване може да бъде количествено оценено лесно и евтино. Въпреки това, диагностичната стойност набъбречнаоценката на тръбното сплескване не е била изследвана преди това. Следователно в това проучване ние изследвахме връзката междубъбречнатубулно сплескване и интерстициална фиброза илибъбречнатубулни маркери за нараняване. Наблюдавахме силна корелация между степента на тубулно увреждане/интерстициална фиброза ибъбречнатръбно сплескване при три вида мишкибъбречно заболяванемодели. Това е предимство, защото могат лесно да се прилагат бързо развиващи се технологии като изкуствен интелект и обработка на изображения; следователно в бъдеще трябва да е възможна по-точна, обективна и количествена диагноза.
Ключови думи:интерстициална фиброза, бъбречно заболяване, сплескване на бъбречните тубули, увреждане на бъбречните тубули; бъбречна недостатъчност
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Пациенти с хроничнизаболяване на бъбреците(CKD) показват симптоми на протеинурия или продължително (повече от три месеца) намаление на скоростта на гломерулна филтрация [15]. Това заболяване е категоризирано във високорисковата група пациенти с терминален стадийбъбречна недостатъчност.Броят на пациентите с ХБН непрекъснато нараства в световен мащаб. Когато ХБН прогресира, това води до краен стадийбъбречна недостатъчност, което изисква диалитично лечение, което струва огромна сума, което води до увеличаване на медицинските разходи [14]. Ето защо е спешно необходимо разработването на нови маркери за проследяване на началото и прогресията на ХБН и установяването на нови методи за лечение. Честите причини за ХБН включват диабет, високо кръвно налягане, гломерулна болест и други рискови фактори за ХБН. Въпреки че всеки тип ХБН показва специфични за заболяването тъканни промени в ранните етапи, тубулното разстройство и интерстициалната фиброза се появяват хистологично в хода на прогресията до краен стадийбъбречна недостатъчност. Бъбречнафиброзата е тъканна промяна, която е свързана главно с тубулно разстройство, свързано с ХБН, и интерстициална фиброза и се счита за значима цел на лечението за предотвратяване на прогресия до краен стадийбъбречна недостатъчност[25]. Следователно, количественото определяне на тубулното разстройство и интерстициалната фиброза при изследване на ХБН с помощта на животински модели е от съществено значение за измерване на степента на тежест на ХБН и следователно ефикасността на терапевтичните средства. Няколко стратегии са използвани за количествено определяне на интерстициалната фиброза, включително оцветяване в червено на Sirius или трихромно оцветяване на Masson за количествено определяне на областите на фибрилизация, точкуване на тубулни нарушения за морфологичен анализ набъбречнатубули и различни маркери за увреждане, като -SMA, липокалин, свързан с неутрофилна желатиназа (NGAL), L-FABP и Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Резултатът от тубулно нарушение включва сплескване, разширяване, дегенерация, атрофия и загуба на границата на четката набъбречнатубули [27]. Сред тези фактори за точкуване,бъбречнатубуларното сплескване (намаляване на височината) може да бъде количествено оценено лесно и евтино [1–3, 19, 20]. Въпреки това, диагностичната стойност на оценката на сплескването на бъбречните тубули не е била изследвана досега. Затова анализирахме връзката между степента на интерстициална фиброза ибъбречнатръбно сплескване взаболяване на бъбреците.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
Етична декларацияВсички експерименти с животни бяха одобрени от президента на университета Китасато след разглеждане от Комитета за грижа и използване на животните на университета Китасато (ID на одобрение: № 19-153, 19-154, 19-155). Мъжки FVB/NJcl (FVB) и BALB/cAJcl (BALB/c) мишки бяха получени от CLEA (Токио, Япония). Всички мишки се поддържат при специфични условия без патогени. Те получиха достъп до стерилна храна и вода ad libitum преди и по време на експериментите.ЖивотниTns2nph модел: FVB-Tns2nph мутантна мишка (FVB-nph) се използва като CKD модел, както е описано в [22]. Модел на исхемия-реперфузия (IR): Създаденият IR модел е извършен, както е описано по-рано [18]. Осемседмични мишки (мъжки FVB) бяха анестезирани чрез вдишване на изофлуран и левите бъбреци на които бяха отстранени, след което мускулният слой и лицето бяха затворени чрез използване на абсорбируем шев. След десет дни възстановяване, мишките бяха анестезирани чрез интраперитонеално инжектиране на комбинацията от лекарства за анестезия, както е описано по-рано [11], технитебъбречнаартериите и вените бяха поддържани в исхемично състояние с артериални скоби (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Япония) съответно за 30 и 60 минути, след което мускулният слой и лицевата страна бяха затворени чрез използване на резорбируем конец. В допълнение, контролни мишки, които са претърпели фиктивна операция, са подложени на отворена операция без скоби. След това всички мишки бяха евтаназирани чрез вдишване на свръхдоза изофлуран (Escain, Pfizer Japan Inc., Токио, Япония), за да се извърши събирането на пробата. Theбъбрецибяха отстранени 24 часа след репликация на исхемия. Модел на индуцирана от адриамицин (ADR) нефропатия: модел на нефропатия: BALB/c мишки на възраст осем седмици бяха приложени или ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Осака, Япония) (10 mg/kg) или физиологичен разтвор (група носители ) през опашната вена, за да оцените технитебъбречно разстройствохистологично на 14-ия ден след приложението.
ХистологияБъбреците на мишките се фиксират с 4 процента параформалдехид (PFA) при 4 градуса за една нощ.Бъбрекблоковете бяха нарязани на 2 µm (за оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS)) и 4 µm (за оцветяване с Picro-Sirius Red). Забъбречнатръбно измерване на височината, страните на кората наБъбрексекциите бяха снимани на случаен принцип в четири различни изгледа (×100). Двама независими изследователи сляпо измерватбъбречнатръбна височина във всички изгледи, за да се изчисли средната височина на всеки обект. За субектите с неравномерни тръбни височини бяха избрани измервания от две до пет места на тубул, за да се получи средната стойност (фиг. 1А). Бяха получени приблизително 700 измервания на тръбна височина на субект, като се използва гореспоменатата процедура за изчисляване на средната стойност за всеки субект. За оцветяване със Sirius Red предметните стъкла се депарафинизират и оцветяват 1 час със Sirius червено в наситен воден разтвор на пикринова киселина и се промиват с 0,5 процента оцетна киселина. За да се оценят областите на фибрилизация с помощта на оцветяване със Sirius червено, целевите зони бяха фотографирани на случаен принцип в осем изгледа (×100) и положителните зони бяха количествено определени с помощта на ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/), за да се изчисли тяхната степен на заетост по отношение на общата площ. Гломерулите, оцветени със Сириус червено, и кръвоносните съдове бяха изключени от изчислението.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
Имунохимично оцветяванеБъбречни срезове (5 цт) се депарафинизират и се подлагат на извличане на антиген в цитратен буфер при 121 градуса за 15 минути. след промиване с Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS),Бъбрексрезовете се запечатват с 0.3 процента водороден прекис/метанол за 20 минути и след това се инкубират за една нощ при 4 градуса с анти-NGAL антитяло (Abcam, Cambridge, UK). Срезовете се промиват с TBS и след това се инкубират с вторично антитяло (Histofine SimpleStain MAX PO (Rabbit), Nichirei Biosciences Inc., Токио, Япония) за 30 минути при стайна температура. След промиване с TBS, срезовете се инкубират с 3,3'-диаминобензидин (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Осака, Япония) и хематоксилин при стайна температура. За да се оцени тубулно разстройство чрез имунохимично оцветяване с помощта на анти-NGAL антитяло, тъканните проби бяха фотографирани на случаен принцип в осем изгледа (×100) и областите на DAB оцветяване бяха количествено определени с помощта на ImageJ за изчисляване на тяхната степен на заетост по отношение на общата площ.
СтатистикаДанните бяха представени като средно ± стандартно отклонение. T-тестът на студента беше използван за тестване на значителни разлики между две групи, а многогруповият тест на Bonferroni беше използван за тестване на множество групи. P-стойност<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni's="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">
РЕЗУЛТАТИ Както бе споменато по-горе, количественото определяне на интерстициалните фиброзни зони с помощта на оцветяване с червено Sirius трябва да бъде стандартният метод за оценка на тубулни нарушения при пациенти сзаболяване на бъбрецитеили взаболяване на бъбрецитемодели. По този начин, за количественото определяне на тубулното разстройство и интерстициалната фиброза, използвайки животински миши модел на ХБН, ние използвахме FVB-Tns2nph мутантна мишка (FVB-nph), която е животински модел на ХБН, който проявява много симптоми на човешка ХБН, която прогресира постепенно за продължителен период от време , включително генетично начало на гломерулосклероза от раждането, фибрилизация на тубулоинтерстициума,бъбречнаанемия ибъбречна недостатъчност[17, 21, 22]. FVB-nph мишка възпроизвежда типичните симптоми, наблюдавани при прогресиране на ХБН при хора. В това проучване въведохме nph мутацията в FVB линии, податливи на нефропатия. Групата с FVB-nph показа повече тубулно сплескване от групата с WT, въз основа на влошаването на фибрилизацията на интерстициума вбъбречнатубули (фиг. 1B–D). Анализът на линейната регресия показва значителна противоположна корелация между тубулната височина и степента на интерстициална фиброза (R2=0.7086: P=0.0023) (Фиг. 1E).
Фиг. 1. (A) Измерване на височината на тубулните епителни клетки. Червените ленти показват височината на тубула. (B) Представителни изображения на оцветяване с периодична киселина по Шиф (PAS) и изображения, оцветени със Sirius Red на 10-седмична FVB-Tns2WT (FVB-WT) (ляв панел) и FVB-Tns2nph мутантна мишка (FVB- nph) (десен панел) бъбречни секции. Горният панел представлява изображения, оцветени с PAS, а долният панел представлява изображения, оцветени с червено Sirius. Скала: 50 µm. (C) Графика, сравняваща тубулните височини на FVB-WT и FVB-nph. (D) Графика, сравняваща площта на фиброзата спрямо общата площ. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение; P-стойностите се изчисляват чрез t-теста на Student. (E) Графиките на разсейване с линейна регресия показват корелационен анализ между височината на височината на тубулите и степента на резултата от фиброзата. Линията на линейната регресия показва обратна корелация между тубулната височина и областта на фиброзата. Показани са стойностите на коефициентите на корелация R и P. Черните кръгове показват групата FVB-WT (n=5), а черните квадрати показват групата FVB-nph (n=5). **P<0.01,><>
Бъбречните тубулни наранявания и тубулни височини бяха измерени с помощта на остърувреждане на бъбреците(AKI) модел - т.е. IR модел [5, 12, 18]. Въпреки че интерстициалната фиброза не трябва да се наблюдава в повечето случаи на AKI, вклбъбречнаисхемично разстройство, повишена експресия на NGAL в бъбречните тубулни клетки [7]. В допълнение, известно е, че NGAL участва в прогресията на AKI към CKD и е предложен като жизненоважен фактор и при двете. Следователно, ние демонстрирахме, че експресията на NGAL корелира сбъбречнатръбна височина с помощта на IR модела. Съобщава се, че времето на исхемия често се определя на 20 до 60 минути и че тубулното увреждане се влошава с увеличаване на времето на исхемия [4, 5, 12, 18]. В това изследване мишките бяха подложени на исхемия за 30 минути като слабо тубулно увреждане и 60 минути като силно тубулно увреждане. Повишена експресия на NGAL и тубулно сплескване се наблюдават в групите на 30 и 60 минути. Увеличаването на експресията на NGAL и сплескването на тубулите е по-изразено в 60-минутната група, тъй като е претърпяла повече нараняване (фиг. 2A-C). Намаляването на тубулната височина и увеличаването на експресията на NGAL бяха демонстрирани въз основа на увеличаване на продължителността на исхемичното състояние (фиг. 2A-C). Линейният регресионен анализ на резултатите също показва отрицателна корелация междубъбречнатубулна височина и експресия на NGAL (R2=0.6266, P=0.011) (фиг. 2D).
Моделът на ADR нефропатия често се използва взаболяване на бъбрецитеизследвания, тъй като предизвиква гломерулни увреждания и незначителни тубулни нарушения с високо ниво на възпроизводимост при използване на единична доза ADR [13]. Моделът на ADR нефропатия при мишка беше използван в това проучване за оценкабъбречнатръбни наранявания и височини. Моделът на гризачи на индуцирана от ADR нефропатия често се използва за обяснение на механизмите на фокална гломерулосклероза (FSGS) и ХБН. Единична доза ADR може да причини загуба на подоцити, персистираща протеинурия и FSGS. Сред различните щамове мишки, BALB/c е чувствителен към ADR, докато C57BL/6 (B6) е резистентен. По този начин използвахме BALB/c в този ADR експеримент. При НЛР нефропатия,бъбречнаинтерстициална фиброза, която е типична находка за ХБН
Фиг. 2. (A) Представителни изображения на оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) и имунохимично оцветени изображения с анти-неутрофилна желатиназа-свързано липокалиново (NGAL) антитяло на фалшив (ляв панел), 30 минути (среден панел) и 60 минути (десен панел) бъбречни срезове. Горният панел представлява PAS-оцветеното изображение, а долният панел представлява имунохимично оцветеното изображение с анти-NGAL антитяло. Скала: 50 µm. (B) Графика, сравняваща тръбните височини на фалшиви, 30 минути и 60 минути. (C) Графика, сравняваща NGAL-позитивната площ спрямо общата площ на фалшива, 30 минути и 60 минути. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение; P-стойностите са изчислени чрез многогруповия тест на Bonferroni. (D) Графиките на разсейване с линейна регресия показват корелационен анализ между височината на височината на тубулите и NGAL-положителната област. Линията на линейната регресия показва обратна корелация между тубулната височина и NGAL-положителните области. Показани са стойностите на коефициентите на корелация R и P. Черните кръгове показват фиктивната група (n=3), черните квадратчета показват 30-минутната група (n=3), а черните триъгълници показват 60-минутната група (n=3). *П<0.05,><>
изявено на 4 седмици след приложението на НЛР, докато междинно състояние между ОПП и ХБН се наблюдава на по-малко от 4 седмици [24]. В настоящото проучване ние оценихме тубулното сплескване при мишки 2 седмици след лечение с ADR, междинно състояние. Нивото набъбречнатубулното увреждане се оценява чрез измерване на експресията на NGAL, която се увеличава в клетките на увредените бъбречни тубули [6]. Бяха измерени височини на бъбречните тубули и беше извършено имунохимично оцветяване с използване на анти-NGAL антитяло върху бъбречните тъкани на групите ADR и носител. Не беше открито положително изображение на оцветяване в червено Sirius (данните не са показани). Тубулното сплескване беше подобрено чрез прилагане на ADR и беше демонстрирано очевидно увеличение на експресията на NGAL (фиг. 3A-C). В допълнение, линейният регресионен анализ на тубулните височини и нивата на експресия на NGAL показа противоположна корелация (R2=0.522, P=0.043) (Фиг. 3D).
ДИСКУСИЯ
В това проучване бяха демонстрирани силни корелации между тубулното сплескване на бъбреците и интерстициалното фиброзиране при тежки модели на ХБН и между тубулното сплескване и тубулното разстройство при ADR и IR моделите. Има различни механизми, чрез които гломерулните лезии се разпространяват до интерстициална фиброза чрез тубулни нарушения. Проучване съобщава, чебъбречнаувреждането на тубулите (сплескване) предизвиква интерстициално фиброзиране, производството на екстрацелуларен матрикс (ECM) и възпалителна клетъчна инфилтрация. Силната връзка междубъбречнатубулното сплескване и бъбречната тубулна интерстициална фибрилизация, наблюдавани в това проучване, вероятно съответстват на докладваната по-рано причинно-следствена връзка; т.е.бъбречнатубулните увреждания предизвикват фиброзиране, производство на ECM и клетъчна инфилтрация. Друго проучване също показа корелация между повишената експресия на NGAL и бъбречната тубулна атрофия (друг резултат от оценката на бъбречно увреждане), с резултати, подобни на резултата за сплескване на бъбречните тубули, получен в това проучване [26]. В това проучване само мъжки
Фигура 3. (A) Представителни изображения на оцветяване с периодична киселина-Шиф (PAS) и имунохимично оцветени изображения с анти-неутрофилна желатиназа-свързано липокалиново (NGAL) антитяло на носител (ляв панел) и адриамицин (ADR) (десен панел) бъбречни участъци. Горният панел представлява PAS-оцветеното изображение, а долният панел представлява имунохимично оцветеното изображение с анти-NGAL антитяло. Скала: 50 µm. (B) Графика, сравняваща тръбните височини на превозното средство и ADR. (C) Графика, сравняваща NGAL-позитивната площ спрямо общата площ. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение; P-стойностите са изчислени чрез многогруповия тест на Bonferroni. (D) Графиките на разсейване с линейна регресия показват корелационен анализ между височината на тубулите и NGAL-позитивната област. Линията на линейната регресия показва обратна корелация между тубулната височина и NGAL-положителните области. Показани са стойностите на коефициентите на корелация R и P. Черните кръгове показват групата превозни средства (n=3), а черните квадрати показват групата ADR (n=5). *П<0.05,><>
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
използвани са мишки, но сплескването на тубулите при нефропатия може да се наблюдава и при двата пола. Съобщава се обаче, че женски мишки са резистентни към IR и други модели на нефропатия, така че трябва да се обмисли използването на мъжки или женски мишки в зависимост от използвания модел на нефропатия [8]. Също така беше трудно да се оцени тубулното сплескване в медулата, тъй като тубулите в медулата по време на ненараняване имат тънки тубулни клетки, въпреки че беше оценена височината на тубулите в кората. Следователно в бъдеще трябва да се разработи прост метод за оценка на тубулното увреждане в медулата (данните не са показани). Експерти като патолози или клиницисти обикновено извършват оценка на нивото на атрофия, разширяване или мутация на бъбречните тубули, за да направят оценка на хистологията на бъбречните тубули; въпреки това, измерването на височината на бъбречните тубули за оценка на нивото на сплескване може да се извърши много по-лесно в сравнение с други методи. Това също е предимство, тъй като могат лесно да се прилагат бързо развиващи се технологии като изкуствен интелект и обработка на изображения; следователно в бъдеще трябва да е възможна по-точна, обективна и количествена диагноза. За да се потвърди дали бъбречното тубулно сплескване може да бъде феномен, който се наблюдава универсално като индекс за злокачествено заболяване на ХБН при различни видове, трябва да се проведат допълнителни изследвания, като се използват модели на ХБН на други гризачи, животни компаньони като кучета и котки или проби, събрани от хора.
