R. Vesicarius L. Проявява нефропротективен ефект срещу индуциран от цисплатин оксидативен стрес
Mar 26, 2022
Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com
М-р Махмудул Хасан1, Повечето. Сайла Тасмин2, Ахмед М. Ел-Шехави3, Мона М. Елсихи4, Md. Абу Реза1и Арифул Хаке2*
Резюме
Заден план:Цисплатинът е изключително противораково лекарство, но употребата му е значително намалена поради тежка нефротоксичност. R. vicarious L. е листен зеленчук с очевиден антиангиогенен, противовъзпалителен, антипролиферативен, хепатопротективен и нефропротективен потенциал. Следователно, това проучване е предназначено да инспектира неговия метанолов екстракт (RVE) за възможен нефропротективен ефект.
Методи:Основно, in vitro, антиоксидантната активност на RVE беше потвърдена въз основа на способността на 2, 2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) за улавяне на свободните радикали. След това, мъжки мишки Swiss Albino бяха третирани с цисплатин (2,5 mg/kg) в продължение на 5 последователни дни, за да се предизвика нефротоксичност. Възстановяването от нефротоксичност се изследва внимателно чрез третиране на животните с RVE (25, 50 и 100 mg/kg) интраперитонеално (ip) за следващите 5 последователни дни. След завършване на лечението, мишките бяха умъртвени и бъбреците бяха събрани. Част от него се хомогенизира в натриев фосфатен буфер за оценка на нивото на малондиалдехид (MDA), друга част се използва за оценка на експресията на ген (NQO1, p53 и Bcl-2). Освен това, капацитетът за неутрализиране на водороден пероксид (H2O2) на RVE беше оценен в HK-2 клетки in vitro. Накрая, биоактивните фитохимикали в RVE бяха определени с помощта на газова хроматография-масспектрометрия (GC-MS).
Резултати:RVE показа in vitro антиоксидантна активност по дозозависим начин с 37,39 ± 1,89 ug/mL IC50 стойност.
Лечението с RVE забележително (p < {{0}}.05)="" намалява="" съдържанието="" на="" mda="" в="" бъбречната="" тъкан.="" освен="" това,="" експресията="" на="" гени="" nqo,="" p53="" и="" bcl-2="" беше="" значително="" (p=""><0,05) смекчена="" в="" зависимост="" от="" дозата="" поради="" прилагането="" на="" rve.="" rve="" значително="" (p=""><0,05) обърна="" нивото="" на="" h2o2="" в="" hk-2="" клетките="" до="" почти="" нормално.="" от="" gc-ms,="" десет="" съединения,="" включително="" три="" известни="" антиоксиданта="" "4h-пиран-4-он,="" 2,="" 3-дихидро-3,="" 5-дихидрокси-6-метил-"="" ,="" "хексадеканова="" киселина"="" и="" "сквален"="" са="" открити.="" екстрактът="" е="" богат="" на="" алкалоид="">
Заключение:Като цяло, RVE притежава защитен ефект срещу индуцирано от цисплатин бъбречно увреждане.
Ключови думи:Цисплатин, R. vicarious, мишки, бъбрек, HK-2 клетки, оксидативен стрес, NQO1 ген
Cistanche deserticola предотвратява бъбречни заболявания, щракнете тук, за да получите пробата
Въведение
Оксидативният стрес е резултат от диспропорция между образуването на реактивни кислородни видове (ROS) и редовните антиоксидантни защитни механизми [1]. Редовните биохимични реакции, честото излагане на неблагоприятна среда и повишеният прием на ксенобиотици водят до производство на ROS [1]. ROS взаимодействат с цистеиновите остатъци на редокс-чувствителни сигнални молекули, включително транскрипционни фактори, протеин тирозин фосфатази и протеин кинази; следователно, окисляването на тиоловите групи върху тези остатъци насочва към промени в целевите протеини, биологични действия, сигнални способности, имунитет и допълнителни клетъчни живи/мъртви парадигми [2]. Кислородсъдържащите химични видове с реактивни свойства са известни като ROS, което включва свободни радикали и нерадикални молекули като супероксид и H2O2, съответно [3]. Оксидативният стрес, предизвикан от ROS, е свързан с етиологията на множество заболявания, включително рак. Острата миелоидна левкемия (AML) е раков растеж на кръвни клетки в костния мозък. Клетъчните и молекулярните събития, лежащи в основата на AML, включват увреждане на ДНК, клонално размножаване, повишена клетъчна смърт и допълнителна генетична нестабилност, които са резултат от ROS-индуциран оксидативен стрес [4]. Човешката физиология е надарена с множество механизми, които могат да генерират антиоксиданти, за да упражняват защита срещу оксидативен стрес, което води до защита на клетките от токсични ефекти и служи за превенция на заболявания [5]. Въпреки това, клетките развиват ендогенни механизми за противодействие на оксидативния стрес и запазване на необходимите ROS [6].
NAD(P)H: хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) е флавоензим [7], който може да катализира редукцията с два или четири електрона и използва това свойство за детоксикация на хинините [8]. Той може да предпази клетките от окислително увреждане, като държи редокс цикъла настрана и като намалява производството на свободни радикали [8]. Освен ксенобиотичната детоксикация, NQO1 също участва в неутрализацията на супероксида, модулирането на протеазомното разграждане на р53 [9], инхибирането на Bcl-2 [10] и повишената чувствителност към клетъчно увреждане [11].
Цисплатин е първото одобрено от Администрацията по храните и лекарствата (FDA) противораково лекарство на основата на платина [12]. Цисплатинът упражнява апоптоза чрез индуциране на оксидативен стрес и свръхекспресия на туморен супресорен ген p53 [12]. Няколко неблагоприятни ефекта, включително нефротоксичност, хепатотоксичност, гастротоксичност, ототоксичност, миелосупресия и невротоксичност са резултат от индуцирания от цисплатин оксидативен стрес [12]. Тези странични ефекти забележително са намалили употребата на цисплатин, въпреки че той има изключителна противоракова активност. Добре известно е, че цисплатинът предизвиква оксидативен стрес и потиска гена NQO1 в бъбреците на мишки [13]. Следователно търсенето и валидирането на ефективни естествени източници на антиоксиданти се превръща в област на осъзнаване. Приемът на диетични антиоксиданти с растителен произход като флавоноиди, каротеноиди и фенолни съединения може да доведе до защита срещу сърдечно-съдови заболявания, катаракта и рак [14].
R. vicarious (Polygonaceae) е известен като "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" на бенгалски [15]. Расте в пустинни и полупустинни райони на Азия, Австралия и Северна Африка [16]. Това е малко проучено застрашено растение в Бангладеш. В Бангладеш хората консумират цялото растение като зеленчук след готвене със сол, различни подправки и масло. Понякога хората използват само пресни листа в смесена салата като алтернатива на марулята. Суровият лист е леко кисел, но след варене става силно кисел. Освен това малко количество листа обикновено се смесват в рибни ястия по време на готвене, за да имат леко кисел вкус.
Това растение се използва като зеленчук и лечебна билка по целия свят [17]. Листата и семената се използват като антидот съответно за змийска и скорпионска отрова [17]. В народното лечение R. vicarious отдавна се използва за лечение на чернодробни заболявания, лошо храносмилане, запек, хемороиди, повръщане, метеоризъм, сърдечни проблеми, болки, нарушения на далака, диспепсия, зъбобол, бронхит, астма, краста, левкодерма и като слабително, стомашно, предястие, тонизиращо, диуретично и аналгетично [18]. Това растение съдържа множество биологично важни съединения, включително флавоноиди, антрахинони, каротеноиди, витамини, липиди и органични киселини, които са добре известни като антиоксиданти, антимикробни и противоракови агенти [19]. Всяка част от това растение съдържа кверцетин (флавоноиди) в повишено количество [15]. Това растение съдържа 0.25 mg витамин A, 1,33 mg витамин C, 2,37 mg витамин E [15], 3,38 mg флавоноиди и 5,66 mg полифеноли [20] на 100 g сухо тегло.
Shahat и колеги [21] показаха антиангиогенни и антипролиферативни ефекти на екстракт от метанол (80 процента) от R. vicarious надземна част срещу хепатоцелуларен карцином в модел на плъх. Друго проучване показва in vitro антиангиогенен потенциал на R. vicarious екстракт [22]. Метаноловият екстракт от цял R. vicarious упражнява защита срещу индуцирана от въглероден тетрахлорид хепатотоксичност in vivo [23]. Противовъзпалителният ефект при зайци е очевиден от метанолов екстракт от листа на R. vicarious [24]. Скорошно проучване [25] докладва in vivo нефропротективен ефект на фракциониран етанолов екстракт от R. vicarious срещу токсичност на гентамицин и калиев дихромат.
Имайки предвид горната информация, ние имахме за цел да проверим ефекта на R. vicarious екстракти (RVE) по отношение на възстановяването от индуцирана от цисплатин нефротоксичност чрез поддържане на NQO1 генната експресия в животински модел.
ползи за здравето на Cistanche: лечение на бъбречни заболявания
Материали и методи
Химикали и реактиви
Цисплатин и 2, 2-дифенил-1-пикрилхидразил (DPPH) са закупени от SIGMA-ALDRICH (САЩ).
Комплект за колориметричен анализ на креатинин (идентификационен номер на продукта – 700,460) е закупен от Cayman Chemical (САЩ). Модифицираната среда на Eagle на Dulbecco (DMEM), фетален говежди серум (FBS) и антибиотик (10,000 U/mL пеницилин и 10,000 ug/mL стрептомицин) бяха закупени от Gibco (Gibco Laboratories, САЩ). Комплектът ROS-Glo™ H2O2 Assay и GoTaq® qPCR Master Mix бяха получени от Promega (САЩ). Комплектът за обратна транскрипция TIAN-Script M-MLV е закупен от TIANGEN (Китай) и праймери от IDT (Integrated DNA Technologies, Малайзия). Всички други химикали и реактиви, използвани в този експеримент, са с аналитичен клас.
Вземане на растителни проби и подготовка на екстракти
Пресни заместващи растения R. са закупени от местен пазар в Sonadighi, Rajshahi, Бангладеш. Растителният екземпляр е идентифициран и удостоверен от д-р Ахмад Хумаян Кабир, Катедра по ботаника, Университет Раджшахи, Бангладеш. Екземпляр по ваучер №. 00095 се съхранява в хербариума на катедрата по ботаника на университета в Раджшахи. Надземните части на растението бяха почистени, изсушени при 37 градуса, смлени на едър прах с помощта на електронна сушилня и съхранени в запечатан контейнер при 4 градуса. Финият прах (10 g) се разтваря в метанол (500 mL). Съдържанието се обработва с ултразвук (Soniprep 150, Китай) при 20 kHz за 10 минути. Филтруването на екстракта се извършва с помощта на филтърна хартия от стъклени влакна (Macherey NAGEL, GmBH, немски) с филтърен апарат DURAN (немски). Накрая, филтратът се концентрира с помощта на сушилня чрез замразяване (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, САЩ). Екстрактът най-накрая беше наречен RVE.
In vitro тест за антиоксидантна активност
In-vitro антиоксидантният капацитет на RVE беше извършен на базата на почистване на DPPH, както е описано по-рано [26] с малка модификация. Способността на RVE за отстраняване на DPPH радикали беше оценена въз основа на превръщането на лилавия цвят на DPPH в жълт цвят. Реакционната смес във всяка микроцентрофужна епруветка (2 mL) се състои от 950 μL метанолов разтвор на DPPH радикали (0,1 mM) и 50 μL RVE от пет различни концентрации (200, 500, 1000, 2000 и 4000 ug /mL метанол), за да се получат крайни концентрации от 10, 25, 50, 100 и 200 ug/mL. Друга епруветка, съдържаща 50 μL метанол и 950 μL метанолов разтвор на DPPH, беше запазена като контрола. Епруветките се оставят за 30 минути на тъмно място. Абсорбцията на смесите се измерва при 517 nm с помощта на GENESYS 10S UV-VIS спектрофотометър (Thermo SCIENTIFIC, САЩ). Накрая, процентът на активността на поглъщане на радикали (RSA) се изчислява въз основа на обезцветяването на DPPH, като се използва следната формула процент RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100, където ADPPH е абсорбцията на разтвора на DPPH (контрола) и ARVE е абсорбцията на разтвора на RVE. Концентрацията, при която RVE води до 50 процента RSA, се нарича IC50 стойност и се изчислява с помощта на графика, поставяща процент RSA спрямо различни използвани концентрации на RVE.
Експериментални животни и експериментален дизайн
Мъжки мишки Swiss Albino на възраст 42 дни (30–32 g телесно тегло) се аклиматизират за 1 седмица преди започване на експеримента в стая (температура от около 25 ± 2 градуса и ~ 50 процента влажност, 12 часа тъмно/светъл цикъл). Питейна вода и храна бяха предоставени ad libitum.
Мишките бяха разделени на случаен принцип в осем групи (n {{0}}). Първата (контролна) група беше третирана с 0.2 mL 0,9 процента NaCl. Следващите четири групи бяха третирани с цисплатин при 2, 5 mg / kg в продължение на 5 дни на интервал от 24 часа. След прилагане на цисплатин, една група (втора група) беше оставена без по-нататъшно лечение и определена като стресирана контролна група. Третата, четвъртата и петата група бяха допълнително третирани с RVE при 25, 50 и 100 mg/kg, съответно в продължение на 5 дни. Други три групи бяха третирани с RVE само при 25, 50 и 100 mg/kg, съответно в продължение на 5 дни. Цисплатин и RVE се разтварят в дестилирана вода. Всички лечения са прилагани интраперитонеално. След 24 часа от последното третиране, животните бяха евтаназирани след дислокация на шийката на матката [25]. След това перитонеумът беше отворен с ножица, кръвта беше събрана след пункция на сърцето и бъбреците бяха събрани с помощта на форцепс. Кръвта се подлага на проверка на нивото на креатинин в серума. Бъбреците бяха подложени на оценка на нивото на малондиалдехид и генната експресия.
Измерване на серумен креатинин
Серумният креатинин беше измерен с помощта на комплект за колориметричен анализ на креатинин-700,460 (Cayman Chemical, САЩ), следвайки протокола на производителя, предоставен с комплекта.
Измерване на бъбречната липидна пероксидация
Малондиалдехидът (MDA) е краен продукт от липидната пероксидация в бъбречната тъкан и обикновено се измерва като индикатор за производството на ROS. Нивото на MDA обаче е измерено в бъбречна тъкан според предишно проучване [27]. Първо, бъбречната тъкан се хомогенизира в натриев фосфатен буфер (0.1 М, рН 7.4). Реакционен разтвор, съдържащ 0.8 процента тиобарбитурова киселина (1,5 mL), 8,1 процента SDS (200 μL), 20 процента (pH 3,5) оцетна киселина (1,5 mL) и dH2O (600 μL) се добавя към 100 μL хомогенизирана тъкан и след това сместа се инкубира при 95 градуса за 1 час. След охлаждане, смесите се центрофугират при 10,000 g за 10 минути при 4 градуса и абсорбцията на супернатантата се измерва при 532 nm със стандартен 1, 1, 3, 3- тетраметокси пропан. Количеството на общия протеин се измерва с помощта на комплекта Bradford Protein Assay (BIO-RAD, САЩ) и чрез сравняването му със стандартен говежди серумен албумин (BSA). Интензитетът на липидните пероксиди се формулира като наномоли (nM) MDA на милиграм (mg) протеин.
Полимеразна верижна реакция в реално време (PCR в реално време)
PCR в реално време се извършва, както е описано по-рано [28, 29]. Общата РНК от бъбречна тъкан се изолира с помощта на TRIzol® реагент (Invitrogen) съгласно протокола, предоставен от производителя. След това изолираната РНК (1 ug) се превръща в сДНК. Първо, 2 μL произволен хексамер (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 ug РНК и свободна от нуклеаза H O до 15 μL бяха взети и инкубирани за 5 минути при 70 градуса. Сместа незабавно се поставя върху лед за 2 минути. След това във всяка епруветка се добавят 4 μL буфер за 1-ва верига (5x) и 1 μL M-MLV обратна транскриптаза и се инкубират за 10 минути и 50 минути.
min при 25 градуса и 42 градуса, съответно. Накрая, ензимът M-MLV обратна транскриптаза се инактивира чрез инкубиране на сместа при 95 градуса за 5 минути. Синтезираните cDNA продукти бяха подложени на PCR в реално време за количествено определяне на NQO1, p53 и Bcl-2 генна експресия, използвайки специфични праймери (Таблица 1). Всяка реакция (10 μL) се извършва в три екземпляра, включваща 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, САЩ), 0,5 μL (10 mM) от всеки праймер, 3 μL вода без нуклеаза и 1 μL cDNA в 48-реакционни плаки с ямки. Термичният цикъл беше извършен с помощта на PCR машина в реално време (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, САЩ) със следните циклични условия: 95 градуса за 10 минути, последвани от 40 цикъла от 95 градуса за 30 s, 50 градуса за 30 секунди и 72 градуса за 25 секунди. Специфичността на PCR реакциите се потвърждава чрез анализиране на кривата на топене при 95 градуса за 15 s, 45 градуса за 15 s и 95 градуса за 15 s. Специфичността на PCR реакциите се потвърждава чрез анализиране на кривата на топене при 95 градуса за 15 s, 45 градуса за 15 s и 95 градуса за 15 s. Относителното количествено определяне на генната експресия се извършва с помощта на ендогенен GAPDH ген като контрола на базата на метода ΔΔCq.
Клетъчна култура и лечение
Епителната клетъчна линия на човешките проксимални тубули на бъбреците, HK-2 клетки, се поддържат в DMEM, допълнен с 10 процента FBS и антибиотици (50 U/mL пеницилин и 50 ug/mL стрептомицин) в инкубатор с 5 процента CO2 и 95 процентна влажност при 37 градуса.
Тест за измерване на H2O2
Нивото на H2O2 в клетките на HK-2 беше оценено чрез използване на комплект ROS-Glo™ H2O2 Assay (Promega, САЩ) съгласно протокола, предоставен от производителя на комплекта. HK-2 клетки (1000 клетки) в 70 μL DMEM бяха поставени в ямки на 96-ямкова микротитърна плака. След като се даде възможност за прикрепване на клетките към повърхността на стената, 10 μL DMEM от ямки на микротитърна плака се заменя с 10 μL цисплатин (25 μM в DMEM) и се държи в инкубатор за 12 часа. След това се добавят 10 μL RVE, за да се направят крайни концентрации 125, 250 и 500 ug/mL в DMEM и се инкубират за още 12 часа. След това към всяка ямка бяха добавени 20 μL H2O2 субстратен разтвор и 100 μL ROS-Glo™ разтвор за откриване. Реакцията се инкубира при стайна температура в продължение на 20 минути. Накрая, луминесценцията беше измерена с помощта на луминометър GloMax (Promega, САЩ).
GC-MS анализ
GC-MS анализ на RVE (разтворен в метанол) се извършва, както е описано по-рано [30], като се използва GCMS-QP2020 (SHIMADZU), включващ автоматичен пробоотборник (AOC{ {5}}s), автоинжектор (AOC-20i) и газов хроматограф (GC-2010 Plus), свързан към масспектрометър, оборудван с SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Капилярна колона Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Носещият газ хелий се поддържа при постоянна скорост на потока от 1,72 mL/min и инжекционен обем от 5 μL се подлага на съотношение на разделяне 10:1. Температурата на инжектора се поддържа на 220 градуса, температурата на източника на йони е 280 градуса, температурата на пещта се програмира от 80 градуса (задържане за 2 минути), с увеличение от 5 градуса/мин до 150 градуса (време за задържане 5,0 min), след това 5 градуса/мин до 280 градуса, завършвайки с 8 минути изотермично при 280 градуса. Масспектрите бяха взети при 1, 5 kV с интервал на сканиране от 0, 5 s и пробата беше пусната в диапазон 45–350 m/z. Забавянето на разтворителя е от 0 до 3 минути, а общото време на работа на GC-MS е 55 минути. Относителната концентрация на откритите съединения се измерва чрез сравняване на неговата средна пикова площ с общата площ. Тълкуването на масспектъра в GC-MS беше извършено с помощта на базите данни на Националния институт за стандарти и технологии (NIST), включително NIST08, NIST08s и NIST14.
Статистически анализ
Статистическите анализи бяха извършени чрез ANOVA, следвайки T3 теста на Dunnett, използвайки IBM SPPS (версия 20) софтуер. Данните са артикулирани като средна стойност ± стандартно отклонение (SD). Значителното сравнение беше разгледано на стр<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Резултати
In vitro тест за антиоксидантна активност
Въпреки че по-рано беше докладвано, че RVE има антиоксидантна активност, ние проверихме отново антиоксидантната активност на нашия екстракт, използвайки капацитета на DPPH за отстраняване на свободните радикали. RVE неутрализира DPPH в зависимост от дозата (фиг. 1). RVE разкрива значителна in vitro антиоксидантна активност и изчислената стойност на IC50 на RVE е 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Измерване на серумен креатинин
Нивото на серумния креатинин при мишки е значително (p < {{0}}.05)="" повишено="" след="" прилагане="" на="" цисплатин="" (таблица="" 2).="" лечението="" с="" rve="" забележително="" (р=""><0,05) подобри="" нивото="" на="" креатинина="" в="" зависимост="" от="" дозата="" (таблица="">
Измерване на бъбречната липидна пероксидация
В сравнение с контролата, цисплатинът значително (p < {{0}}.05)="" увеличава="" съдържанието="" на="" mda="" в="" бъбречната="" тъкан="" на="" мишки="" (таблица="" 3).="" за="" разлика="" от="" това,="" лечението="" с="" rve="" значително="" (p=""><0,05) възстановява="" mda="" до="" почти="" нормално="" ниво="" в="" зависимост="" от="" дозата="" (таблица="">
PCR в реално време
Цисплатин значително (p < {{0}}.05)="" намалява="" експресията="" на="" nqo1="" mrna="" с="" 0.15-кратно="" и="" повишава="" p53="" и="" bcl-2="" mrna="" израз="" съответно="" с="" 24="" и="" 42-кратно="" (фиг.="" 2).="" rve="" значително="" (p="">< 0.05)="" смекчи="" nqo1,="" p53="" и="" bcl-2="" mrna="" експресията="" по="" дозозависим="" начин="" (фиг.="" 2).="" в="" сравнение="" с="" групата,="" лекувана="" само="" с="" цисплатин,="" експресията="" на="" nqo1="" ирнк="" се="" повишава="" с="" 3,57,="" 6,36="" и="" 9.28-кратно="" при="" 25,="" 50="" и="" 100="" mg/kg="" rve,="" съответно="" (фиг.="" 2а).="" отново,="" експресията="" на="" p53="" mrna="" беше="" намалена="" с="" 0.63,="" 0.46="" и="" 0.21-кратно="" при="" 25,="" 50="" и="" 100="" mg/kg="" rve,="" съответно="" (фиг.="" 2b).="" експресията="" на="" bcl-2="" mrna="" също="" беше="" намалена="" с="" 0,71,="" 0,40="" и="" 0.32-кратно="" при="" 25,="" 50="" и="" 100="" mg/kg="" rve,="" съответно="" (фиг.="" 2c).="" но="" не="" са="" открити="" значими="" (p=""> 0,05) промени в нивото на експресия на гените NQO1, p53 и Bcl-2 поради лечение с RVE (фиг. 3).
H2O2измервателен анализ
В анализа за измерване на H2O2, H2O2нивото се счита за пропорционално на луминесценцията. Прилагането на цисплатин значително (p < {{0}}.05)="" повишава="" нивото="" на="" h2o2="" с="" 2.2-пъти="" (фиг.="" 4).="" лечението="" с="" rve="" значително="" намалява="" (p="">< 0.05)="" нивото="" на="" h2o2="" с="" 0,25,="" 0,38="" и="" 0.49-кратно="" при="" 125,="" 250="" и="" 500="" ug/ml,="">
GC-MS анализ
Общо 10 съединения (Таблица 4 и Фиг. 5), включително "Изоборнеол, пентаметилдисиланилов етер (сесквитерпенов алкохол)", "Тимин (пиримидинова нуклеобаза)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}дихидро-3,5-дихидрокси-6-метил- (сапонин)", "Хексадеканова киселина, метилов естер (метилов естер на мастна киселина)", "9,12- Октадекадиенова киселина, метилов естер (метилов естер на мастна киселина)", "9-октадеценова киселина (Z)-, метилов естер (метилов естер на мастна киселина)", "Метил стеарат (метилов естер на мастна киселина)", "Диизооктил фталат (естер)", "13-докозенамид, (Z)-(алкалоид)" и "Сквален (тритерпен)" са открити в RVE.
ползи от cistanche tubolosa: понижаване на липидите в кръвта
Дискусия
Естествените и синтетичните антиоксиданти са подробно проучени и е разкрито, че са функционални или за предотвратяване, или за подобряване на токсичността във физиологията на животните [31]. Антиоксидантните добавки са компонент, разработен или чрез химичен синтез, или чрез екстракция от естествени храни, но те не са идентични по състав с наличните антиоксиданти в храната [5]. Следователно мненията се разделят във времето дали синтетичните антиоксиданти дават или не подобни ползи за здравето като естествените антиоксиданти [32]. Появява се желанието да се намали употребата на синтетични антиоксидантни добавки и да се търсят алтернативни, евтини, възобновяеми, естествени и евентуално по-безопасни източници на ефективни естествени антиоксиданти.
Един от най-важните механизми е пътят на свързания с ядрения фактор еритроид{0}} фактор-2 (Nrf2), който обикновено предпазва клетките от оксидативен стрес, предизвикан от екзогенни или ендогенни стресори [27]. Ефективните антиоксиданти индуцират експресия на Nrf2, която по-нататък се придвижва в ядрото и се свързва с елемента на антиоксидантен отговор (ARE), който провокира експресията на фаза II детоксикиращ и антиоксидантен ген NQO1 [33, 34]. NQO1 е широко и различно експресиран по тъканно-специфичен начин. NQO1 е цитозолен антиоксидантен флавопротеин, който катализира 2-електронната редукция на хинони до хидрохинони, което води до детоксикация на електрофилите и очакване на редокс цикъл [35]. Според предишно проучване [36], -lapachone активира NQO1, което допълнително повишава вътреклетъчното ниво на NAD плюс и предпазва бъбрека от индуцирано от цисплатин остро увреждане.
Известно е, че цисплатинът предизвиква увреждане на гломерулната филтрационна мембрана чрез оксидативен стрес, възпаление и апоптоза, които заедно водят до намалена скорост на гломерулна филтрация и загуба на нормална пропускливост на мембраната [37]. Следователно нивото на серумния креатинин е повишено. Серумният креатинин е един от потенциалните маркери за бъбречна функционалност. Лечението с цисплатин повишава съдържанието на MDA в бъбречната тъкан, което е вторичен продукт на липидната пероксидация и този доклад е постоянен с предишни проучвания [27, 35, 37, 38]. Лечението с RVE значително намалява съдържанието на MDA в бъбречната тъкан. В същото време нивото на креатинина също беше намалено, което показва мелиоративния ефект на RVE.
Освен това експресията на NQO1 беше значително намалена, а експресията на p53 и Bcl-2 беше значително повишена след излагане на цисплатин. По отношение на експресията на NQO1 и p53 in vivo, нашият резултат е в съответствие с предишно проучване [13]. Скорошно проучване [39] показа, че цисплатин значително намалява експресията на Bcl-2 в бъбреците на мишки, но изненадващо открихме повишена експресия. Тази разлика може да е резултат от разлика в дозата [40], тъй като Мохамед и колеги [39] използваха 8 mg/kg за 12 дни, докато ние използвахме 2,5 mg/kg само за 5 дни. Друго проучване [41] посочва, че цисплатинът може да увеличи експресията на Bcl-2 в доза, когато не е цитотоксичен. Отново повишената експресия на Bcl-2 сенсибилизира клетките към оксидативен стрес [40].
Въпреки това, експресията на р53 е ниска при нормални физиологични условия, но се очаква да бъде регулирана нагоре, след като бъде лекувана с цисплатин, тъй като този базиран на платина химиотерапевтичен агент активира зависим от р53 апоптотичен път. След като третирахме мишки с цисплатин, p53 беше значително повишен в бъбреците на мишки в сравнение с контролата. Друг протоонкоген Bcl-2 също е свързан с нивото на експресия на NQO1. Имитирайки експресията на p53, ние също открихме, че нивата на Bcl- 2 са повишени с лечение с цисплатин, но са покрити значително при лечение с RVE. Това е възможно, в отговор на оксидативен стрес, генът p53 се активира и води до спиране на клетъчния цикъл, стареене или апоптоза [6]. С детоксикацията свръхекспресията на NQO1 често се счита за свързана с апоптозата в раковите клетки [10], въпреки че основният механизъм на апоптозата и свръхекспресията на NQO1 все още е спорен. Освен това, при хепатоцелуларен карцином, свръхекспресията на NQO1 намалява експресията на Bcl-2 [10]. Протоонкогенът Bcl- 2 също има p53 като корелация с експресията на NQO1. p53 е специфичен за последователността транскрипционен фактор, който се активира от множество видове клетъчен стрес [42], докато свръхекспресията на Bcl-2 действа като стабилизатор на митохондриалните пори, за да улесни освобождаването на цитохром-с при оксидативен стрес [12]. В нашия случай проверихме и двата генни отговора с лечение с цисплатин в нормална бъбречна тъкан и открихме тяхната повишена експресия. Лечението с RVE върна експресията на p53 и Bcl-2 до почти нормална по дозозависим начин. Този тип анулиране на израз на Bcl-2 също беше показано с помощта на ROS акцептор Trolox [43]. Освен това, нивото на H2O2 също е значително повишено в HK-2 клетки поради лечение с цисплатин in vitro. След лечение с RVE, нивото на H2O2 беше значително възстановено до около нормалното. Това може би се дължи на ефекта от лечението с RVE, което повишава експресията на NQO1 [44], което упражнява защита срещу оксидативен стрес [6].
GC-MS хроматограмата потвърди съществуването на десет съединения в RVE. Сред тях "4H-Пиран- 4-он, 2, 3-дихидро-3, 5-дихидрокси-6-метил-", "Хексадеканова киселина" и " Сквален“ са добре известни антиоксиданти [45–47]. Тези три съединения заедно вероятно са проявили синергичен нефропротективен ефект. Предишни проучвания също съобщават за индуциране на експресия на NQO1 от витамин А [48], витамин С [49], витамин Е [50], флавоноиди [51] и полифеноли [50]. Следователно този доклад предлага да се изясни дали този конкретен екстракт съдържа нещо сред витамин А, витамин С, витамин Е, флавоноиди и полифенол или не.
Заключение
Цялостното откритие предполага, че RVE е физиологично ефективен за защита на бъбреците от увреждане, предизвикано от цисплатин. Следователно е изключително важно да се изяснят точните съединения, отговорни за смекчаване на индуцираната от цисплатин нефротоксичност, която може да стане полезна за приложение при хора.
екстракт от Cistanche tubolosa
Благодарности
Авторите са благодарни на Съвета за научни и промишлени изследвания в Бангладеш (BCSIR), клон Rajshahi за предоставяне на лабораторна подкрепа за количествено определяне на РНК.
Авторски принос
MMH извършва експериментален дизайн, експериментиране, анализ и подготовка на данни, писане и редактиране на ръкописи, преразглеждане и изготвяне на ръкописи; MST & MME извършени експерименти и анализ на данни; AME & MAR допринесоха за надзор и ресурси; AH отговаряше за концептуализацията, надзора, ресурсите и редактирането на ръкописи. Всички автори
прегледа ръкописа. Авторите прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.
Финансиране
Настоящата работа е финансирана от изследователи от университета в Таиф, подкрепящ проект номер (TURSP - 2020/75), университет в Таиф, Таиф, Саудитска Арабия.
Наличие на данни и материали.
Всички съответни данни са налични и могат да бъдат предоставени при поискване на съответния автор.
Декларации
Етично одобрение и съгласие за участие
Етиката за извършване на този експеримент е одобрена от Комитета по институционална животните, медицинска етика, биобезопасност и биосигурност (IAMEBBC), Институт по биологични науки (IBSc), Университет Раджшахи, и е предоставена под бележка номер 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Всички методи бяха извършени съгласно насоките и разпоредбите, предоставени от гореспоменатата етична комисия. Това проучване е проведено в съответствие с насоките на ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). „Съгласие за участие“ не е приложимо за това проучване.
Подробности за автора
1 Лаборатория за молекулярна биология и протеинови науки, Катедра по генно инженерство и биотехнологии, Факултет по науки за живота и земята, Университет Раджшахи, Раджшахи 6205, Бангладеш. 2 Лаборатория по молекулярна патология, Институт по биологични науки, Университет Раджшахи, Раджшахи 6205, Бангладеш. 3 Департамент по биотехнологии, Научен колеж, Таифски университет, пощенска кутия 11099, Таиф 21944, Саудитска Арабия. 4Катедра по генетика, Факултет по земеделие, Александрийски университет, Александрия 21545, Египет.
Препратки
1. Bagchi K, Puri S. Свободни радикали и антиоксиданти в здравето и болестта: преглед. East Mediterr Health J. 1998; 4: 350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH и др. Ферулатът, активен компонент на пшеничния зародиш, подобрява предизвикания от оксидативен стрес PTK/PTP дисбаланс и инактивирането на PP2A. Toxicol Res. 2018; 34 (4): 333–41.
3. Хасан AI, Ибрахим RY. Някои генетични профили в черния дроб на Ehrlich асцитни мишки, носещи тумор, подложени на стрес от облъчване. J Radiat Res Appl Sci. 2014; 7 (2): 188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY и др. Участие на оксидативния стрес в рецидива на остра миелоидна левкемия. J Biol Chem. 2010; 285 (20): 15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Свободни радикали, антиоксиданти при болести и здраве. Int J Biomed Sci. 2008; 4: 89-96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Роли на NAD (P) H-хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) върху прогресията на рака и химиорезистентността. J Clin Exp Oncol. 2017; 6: 1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: хинон оксидоредуктаза 1 (NQO1) в чувствителността и резистентността към антитуморни хинони. Biochem Pharmacol. 2012; 83 (8): 1033-40.
8. Динкова-Костова А. Т., Талалай П. NAD (P) H: хинон акцепторна оксидоредуктаза 1 (NQO1), многофункционален антиоксидантен ензим и изключително многостранна цитопротекция. Arch Biochem Biophys. 2010; 501 (1): 116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP и др. Дикумарол инхибира NADPH: хинон оксидоредуктазата индуцира инхибиране на растежа на рак на панкреаса чрез супероксид-медииран механизъм. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Свръхекспресия на NAD (P) H: хинон оксидоредуктаза 1 инхибира клетъчната пролиферация на хепатоцелуларен карцином и индуцираната апоптоза чрез активиране на AMPK/PGC-1 пътя. DNA Cell Biol. 2017; 36 (4): 256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Потискането на NAD (P) H-хинон оксидоредуктаза 1 повишава чувствителността на клетките на холангиокарцинома към химиотерапевтични средства. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Цисплатин в терапията на рак: молекулярни механизми на действие. Eur J Pharmacol. 2014; 740: 364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmercaptocysteine отслабва индуцираната от цисплатин нефротоксичност чрез потискане на апоптозата, оксидативния стрес и възпалението. хранителни вещества. 2017; 9 (2): 166.
14. Matkowski A. Растителна in vitro култура за производство на антиоксиданти - преглед. Biotechnol Adv. 2008; 26 (6): 548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Антиоксидантна активност на Rumex vicarious L. на вегетативния етап на растеж. Азиатски J Pharm Clin Res. 2012; 5: 111-7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) в Австралия: преразглеждане. Нуйция. 1984; 5: 75-122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Индукторна активност на хинон оксидоредуктаза 1 на някои лечебни растения от Саудитска Арабия. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Профил на биоактивни съединения на Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011; 76 (8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF и др. Източници на алфа-, бета-, гама-, делта- и епсилон-каротин: преглед от двадесети век. Rev Bras. 2008; 18 (1): 135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Фитохимичен скрининг, in vitro антиоксидантна и антибактериална активност на екстракт от Rumex vicarious L. Научно проучване Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017; 18: 367–76.