Намаляване на увреждането на бъбречната консервация/реперфузия чрез контролирана хипертермия по време на машинна перфузия Ex Vivo

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Томас Минор1,*,† и Шарлот фон Хорн1,†

Възможният рено-защитен ефект на контролирано кратко лечение с топлинен шок по време на изолирана ex vivo машинна перфузия на донорни присадки предиреперфузиятрябва да бъдат изследвани в първично in vitro проучване.Свинскобъбреци(n=14) бяха извлечени след 20 минути спиране на сърцето на донора и подложени на 20 часа статично студено съхранение в разтвор на Университета на Уисконсин. Предиреперфузия, бъбрецибяха подложени на 2 часа възстановяваща машинна перфузия с постепенно повишаване на температурата на перфузия до 35 градуса. В половината отбъбреци(n=7), кратък хипертермичен импулс (10 минути перфузия при 42 градуса) е приложен в периода на машинна перфузия. Функционално възстановяване на присадките се наблюдава при нормотермична реперфузия in vitro. Хипертермичното третиране доведе до 50 процента увеличение на протеина на топлинен шок (HSP) 70 и HSP 27 mRNA и беше придружено от ~ 50 процента подобрение на тубулната реабсорбция на натрий и глюкоза при реперфузия, в сравнение с контролите. Освен това, бъбречната загуба на аспартат аминотрансфераза е значително намалена до една трета от контролите, както и загубата на протеин в урината, оценена чрез съотношението албумин към креатинин. Направено е заключение, че ex vivo лечението с топлинен шок изглежда лесно приложима и обещаваща опция за подобряване на механизмите за самозащита на бъбреците срещуреперфузиянараняванеслед консервиране, което заслужава допълнително изследване в предклинични модели.

Cistanche dr vita opcе много добър забъбрекреперфузия

Проучване Акценти

КАКВО СА ТЕКУЩИТЕ ЗНАНИЯ ПО ТЕМАТА?

✔ Индукцията на протеини от топлинен шок (HSPs) в местните тъкани е добре познат защитен механизъм в отговор на стреса от околната среда. Повишената регулация на тези молекулярни шаперони индуцира възстановителни механизми и толерантност срещу последващите клетъчнинараняване. Клиничнибъбректрансплантацията все повече разчита на използването на разширени критерии донорски органи, които носят повишена чувствителност към исхемия/реперфузиянараняване. Машинната перфузия ex vivo на маргинални органни присадки осигурява привилегирован достъп до присадката и нова перспектива за лесно и контролирано прилагане на хипертермична стимулация към изолирания орган, за да се предизвикат реакции на топлинен шок и да се отприщят сигнални пътища, които повлияват благоприятно последователното влошаване на тъканите нараняване и подобряванебъбречнавъзстановяване след трансплантация.

КАКЪВ ВЪПРОС СЕ РАЗГЛЕЖДА ТОВА ПРОУЧВАНЕ?

✔ Изследваме потенциален защитен ефект на кратък хипертермичен стимул по време на ex vivo предтрансплантациябъбрекперфузиявърху функционалния резултат при постисхемиченреперфузия.

КАКВО ДОБАВЯ ТОВА ПРОУЧВАНЕ КЪМ НАШИТЕ ЗНАНИЯ?

✔ Това проучване дава някои индикации, че хипертермичното лечение по време на ex vivo бъбречна машинна перфузия действа като възможен нов инструмент за подобряване на функционалните резултати на незначително запазенибъбреципри постисхемична реперфузия. Данните подкрепят съответната роля на HSPs за намаляване на клетъчното разрушаване и подобряване на посттрансплантационна тубулна бъбречна функция.

КАК ТОВА МОЖЕ ДА ПРОМЕНИ CLINICAL PHARMACOL

OGY ИЛИ ТРАНСЛАЦИОННА НАУКА?

✔ Добавянето на кратка контролирана хипертермия към установен протокол за нормотермична машинна перфузия е лесно приложим метод за клинично приложение и може да допринесе за подобрено възстановяване на орган след трансплантация.

Клиничната бъбречна трансплантация все повече и повече разчита на използването на разширени критерии за донорски органи, които са били увредени преди извличането или вероятно са по-малко от оптималните

качество. Наред с нарастващия дял на тези органи, които носят повишена чувствителност към увреждащи тригери при исхемично запазване,1,2 тъканни изменения

свързани с исхемия/реперфузионно увреждане, представляват нарастващ основен проблем при бъбречна трансплантация, който предизвиква клетъчна дисфункция при реперфузия.

Индукцията на клетъчни шаперони и задействането на защитен сигнален фенотип (напр. чрез субкритичен термичен стрес) е добре известен механизъм за намаляване на тъканните изменения, свързани с по-късна стресова ситуация и предизвикване на тъканната хомеостаза.3,4

Появата на изолирана машинна перфузия като алтернатива или допълнение към исхемичното хладно съхранение на маргинални донорски присадки отвори нова перспектива за лесно и контролирано прилагане на хипертермично предизвикателство към изолирания орган, за да предизвика реакция на топлинен шок и да отприщи сигнал пътища, които повлияват благоприятно последователното обостряне на тъканно увреждане и подобряват възстановяването на бъбреците след трансплантация.

Експериментално е доказано, че прекондициониращият ефект на реакцията на топлинен шок е свързан с временно свръхнормално повишаване на циторезистентността5, както и че действа чрез усилване на механизмите за вторично клетъчно възстановяване.6 Съвсем наскоро беше показано, че индукцията на протеини на топлинен шок (HSPs) може да осигури защита дори когато е индуциран рано след като първоначалното увреждане на тъканта вече е настъпило.7

Привилегированият достъп до изолирания орган изключва тромавите изисквания за нагряване на цялото тяло и причинява неблагоприятни странични ефекти върху организмите на донора или реципиента.

Поради това, това проучване е предназначено като пилотно изследване за внимателно изследване на първични доказателства за хипертермично лечение по време на ex vivo бъбречна машинна перфузия, за да действа като възможен нов инструмент за подобряване на функционалния резултат на маргинално запазени бъбреци при постисхемична реперфузия.

МЕТОДИ

Всички експерименти бяха проведени върху бъбреци, които бяха извлечени от мъртви женски прасета от немски ландрас (възраст: 10-12 седмици, тегло: 25 и 30 kg). Федералният закон относно защитата на животните и принципите за грижа за лабораторни животни (публикация на Националния институт по здравеопазване (NIH) № 85-23, ревизирана 1985 г.) бяха спазени. Животните са третирани по правилата и след одобрение от местните власти.

Бъбреците се отстраняват 20 минути след спиране на кръвообращението и се промиват върху задната маса със 100 cm гравитация със студен (4 градуса) разтвор на Университета на Уисконсин, докато изтичащият поток стане бистър. Никога не е даван хепарин.

След това присадките се съхраняват в продължение на 18 часа в чаша, пълна с разтвор на Университета на Уисконсин и температура, регулирана до 4 градуса с помощта на криотермостат.

В контролната група след това бъбреците бяха подложени на 2 часа наситена с кислород (95 процента O2; 5 процента CO2) нормотермична машинна перфузия с разтвор на Aqix RS I, допълнен с 40 g/L говежди серумен албумин. Както беше предложено по-рано, 8,9 перфузията започна при хипотермия, последвано от постепенно повишаване до 35 градуса през първите 60 минути, контролирано от програмируем циркулиращ криотермостат.

В експерименталната група кратък период на контролирана хипертермия (CH) беше включен в изолираната перфузия

Ex Vivo лечение с топлинен шок на малки присадени органи и протокол на von Horn. След достигане на 35 градуса, температурата на перфузата беше временно повишена допълнително до 43 градуса за 10 минути (Фигура 1) преди продължаване на перфузията при 35 градуса за остатъка от 2-часовия период. Времето и височината на повишаване на температурата са получени от предходни инкрементални експерименти за скрининг, целящи да се получи постоянен ефект.

В три експеримента, парциалното налягане на кислорода в тъканта се контролира чрез използването на оптичен кислороден сензор от микрофибърен тип игла, свързан към температурно компенсиран фиброоптичен кислороден метър (Microx 4, PreSens precision sensing, Регенсбург, Германия), който едновременно записва съответната температура с помощта на термисторна сонда.

Иглата беше поставена във вътрешната кортикална област на бъбрека, за да се документира адекватна тъканна оксигенация дори по време на хипертермични периоди на перфузия.

Модел на реперфузия на изолиран бъбрек

Възстановяването на бъбреците от увреждане при запазване/реперфузия беше оценено с помощта на установен модел на реперфузия in vitro, както е описано по-горе.10

Накратко, бъбреците се промиват със студено със 100 mL физиологичен разтвор в края на периода на възстановяване на машината и след това се държат при стайна температура за 20 минути, за да се симулира вторият период на топла исхемия по време на хирургическата имплантация in vivo. Това време беше използвано и за канюлиране на уретера с голяма тръба, за да се даде възможност за събиране на урина при реперфузия.

Бъбреците се поставят в термостатично контролирана камера от плексиглас и се перфузират през бъбречната артерия при средно пулсиращо налягане от 90 mmHg. Венозният флуент се оттича свободно в резервоара. Оксигенирането на перфузата се извършва с 95 процента O2/5 процента CO2, като се използва термо-контролиран оксигенатор с кухи влакна. Артериалното налягане се поддържа с помощта на серво-контролирана ролкова помпа във връзка с датчик за налягане, свързан към артериалната перфузионна канюла. Урината беше събрана от PE-тръбата, поставена в уретера, която беше насочена към външната страна на резервоара. Всеки 100 ml събрана урина се филтрира и се влива отново в резервоара, за да

Фигура 1БъбречнаpO2 на кортикална тъкан (пунктирана линия) по време на ex vivo машинна перфузия по отношение на съответната температура на перфузата (плътна линия).

за поддържане на постоянен електролитен състав на перфузата във времето.

Аналитични процедури

Парциалното налягане на кислорода и концентрациите на перфузат на глюкоза и електролити бяха измерени в анализатор на рН-кръвен газ (ABL 815flex acid-base laboratory, Radiometer, Copenhagen).

Ензимната активност на аспартат аминотрансфераза (AST) и концентрациите на креатинин се определят по рутинен начин чрез отражателна фотометрия на Reflotron Plus пункт за грижа (Roche Diagnostics, Манхайм, Германия).

Бъбречнаклирънсът се изчислява за съответните интервали като креатинин в урината × поток на урина/перфузиран креатинин.

Концентрацията на албумин във фракцията на урината в края на експеримента се измерва фотометрично, като се използва тестът за свързване на багрилото с бромокрезолово зелено в лабораторния център на университетската болница и количеството протеин се нормализира спрямо съответните концентрации на креатинин като албумин в урината до креатининово съотношение.

Филтрираното натоварване на натрий (FL Na) се изчислява като

FL=GFR × Na

FRNa=(FLNa − Na(урина) ×поток на урина)∕FLNa

Филтрираното натоварване и фракционната реабсорбция на глюкоза се изчисляват съответно.

Обратна транскрипция и последваща полимеразна верижна реакция

Общата РНК се изолира от бързо замразени тъканни проби от външната кора и се анализира, както е описано по-горе.8

Базовите стойности бяха изчислени от тъканни проби, взети от жизненоважнибъбрециex vivo. Резултатите се определят количествено с помощта на метода ΔΔCt. Целевите гени бяха нормализирани до глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа като вътрешен стандарт. Стойностите на кратната генна експресия бяха изчислени за всяка отделна проба като нормализирани спрямо базовите стойности.

Следните праймери (закупени от Qiagen GmbH, Hilden, Германия) бяха използвани в изследването: глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа (№ PPS00192A), HSP72 (№ PPS00074A), HSP27 (№ PPS01262) и HO{ {6}} (№ PPS01191A).

Western Blot

Протеиновият имуноблотинг се извършва от лизати на цели клетки от външната странабъбречнакортекс чрез електрофореза с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел и електрофоретичен трансфер върху нитроцелулозна мембрана, както е описано по-горе. 8 Оцветяването беше направено с Ponceau S, проверена равномерност на протеиновото натоварване и трансфер.

Инкубирането с първични антитела се извършва една нощ при 4 градуса (заешка анти-фосфо екстрацелуларен сигнал-регулирана киназа (ERK, Thermo Fisher, #MA5-15174—1:500) или анти HSP 72 (StressMarq Bioscience, #SCM -100—1:300).След инкубиране с вторично антитяло, свързано с пероксидаза от хрян (1:1,000) в продължение на 1 час при стайна температура, протеинът беше открит чрез усилена хемилуминесценция с помощта на C-Digit Blot Скенер (Li-COR).

Количественото определяне на протеиновото съдържание се извършва денситометрично с UN-SCAN-IT гел версия 6.1 (Silk Scientific, Orem UT), нормализирано спрямо експресията на общия ERK (Thermo Fisher, #MA5-15174) или ß-актин (Thermo Fisher , #PA1-46296).

Статистика

Всички стойности са изразени като средни стойности ±SD за n {{0}} животни на група и разликите между групите са тествани чрез несдвоен, двустранен t-тест, използвайки корекцията на Welch за неравни вариации, ако не е посочено друго. Статистическата значимост беше определена на P <>

РЕЗУЛТАТИ

Машинна перфузия

По време на контролирано затопляне с кислород на машинно перфузираните присадки, временната хипертермия доведе до видим преходен спад вбъбречнаpO2 на кортикалната тъкан (Фигура 1), който въпреки това винаги остава над 200 mmHg и по този начин ясно отговаря на физиологичните изисквания по време на нормотермична перфузия, за които се съобщава, че са 30–50 mmHg.11,12

Бъбречнаосвобождаването на AST в циркулиращия перфузат е дори малко по-ниско в групата с хипертермия, отколкото при контролни условия (19,8 ± 12,1 спрямо 33,3 ± 25,9 U/L; CH спрямо контрола, незначително).

Молекулярно отчитане на преходна хипертермия по време на ex vivo машинна перфузия

Съхраняването и реперфузията водят до забележимо индуциране на HSP дори при контролни условия с ~ 2-кратно, 8-кратно и дори 100-кратно увеличение на иРНК транскриптите на хемоксигеназа 1, HSP 27 и HSP 72, съответно.

Независимо от това, контролираната преходна хипертермия по време на машинна перфузия ефективно повишава това увеличение на генната индукция с около 50 процента във всички случаи. Установено е, че ефектът е силно значим за HSP 27, както и за HSP 72, докато не може да се докаже статистическа значимост по отношение на индукцията на хемоксигеназа 1 (Фигура 2).

Фосфорилирането на ERK представлява бързо, отзивчиво защитно сигнално събитие, което може също да насърчи експресията на HSP 72.13

Изследвано е като ранно отражение на топлинния стрес върху нивото на протеина. Western blot анализите разкриха, че преходната хипертермия по време на машинна перфузия значително повишава количеството на ERK фосфорилиране в тъканта в сравнение с контролната група (Фигура 3). Съответно беше установено също, че протеиновата експресия на HSP 72 е значително повишена над контролните стойности след контролирана хипертермия по време на машинна перфузия.

Преходната хипертермия се подобрявабъбречнавъзстановяване след консервация

Потокът на перфузат по време на реперфузия е средно между 300 и 400 mL/минута без разлики между двете

групи. Производството на урина също е сходно и в двете групи с 897 ± 354 срещу 601 ± 280 mL/90 минути (контрола спрямо CH).

Бъбречнаосвобождаването на AST се приема като параметър на глобалното клетъчно увреждане и се проследява по време на реперфузия (Фигура 4). Вижда се, че хипертермичното лечение води до първоначално по-ниски стойности в началото на реперфузията и допълнително смекчава прогресивното покачване по време на продължаващата перфузия.

Бъбречнафункцията на тубулните клетки беше оценена чрез анализ на реабсорбцията на натрий и глюкоза от ултрафилтрата (Фигура 5). Установено е, че фракционните скорости на реабсорбция отбъбреци, подложени преди това на контролирана хипертермия по време на машинна перфузия, значително надминават тези на контролната група с ~ 40 процента.

За да се изключи възможността контролътбъбрециможе да са били натоварени с абсолютно по-високи натоварвания на натрий или глюкоза в ултрафилтрата, ние също определихме общото филтрационно натоварване на двете вещества, което обаче не се различава между двете групи с FL Na в размер на 2,7 ± {{3 }}.7 и 2.5 ± 0.8 mmol/минута и FL glu до 24.8 ± 12.1 и 28.6 ± 9.4 mg/min (съответно контрола срещу CH).

Скоростите на гломерулна филтрация също са двусмислени и в двете групи; стойностите на клирънса на креатинина възлизат на {{0}}.25 ± 0.06 mL/g/минута в контролната група и до 0,24 ± 0,08 mL/g/минута след CH.

За разлика от това, изтичането на протеин в урината е значително намалено вбъбрецикоито са били подложени на CH (Фигура 6).

ДИСКУСИЯ

Използването на ex vivo машинна перфузия представлява развиваща се тенденция в управлението на запазването на присадката преди трансплантацията на органи.

През последното десетилетие хипотермичната машинна перфузия се утвърди като превъзходен метод за запазване в сравнение с простото статично хладилно съхранение14,15 и стана популярна за запазване на органи с по-висок риск, както и органи с разширени критерии.14-16

Показано е, че пулсиращата стимулация на васкулатурата по време на екстракорпоралния период17, както и наличието на кислород18 поддържатбъбречнахомеостаза и подобряванефункционаленрезултати след трансплантация.

Последните технически постижения насърчиха нова тенденция към нормотермична машинна перфузия като по-физиологична алтернатива на технологиите за хипотермична перфузия, която компенсира по-високите разходи чрез подобрено поддържане на метаболитната хомеостаза и по-автентична възможност за оценка на запазената присадка преди трансплантацията.19,20

Освен това, нормотермичната машинна перфузия представлява идеална платформа за терапевтични интервенции на изолирания орган, които могат да служат за целите на кондиционирането, насочени към облекчаване на последствията от предшестващо нараняване при извличане/запазване или за предварителна подготовка срещу по-късно реперфузионно увреждане след втора топла исхемия и реперфузия при трансплантация.

cistanche бъбрек wirkung

Установено е, че лечението с топлинен шок като терапевтичен подход насърчава много ефективни защитни механизми в бъбреците и предизвиква толерантност към специфични обиди чрез стабилизиране на протеиновата структура и клетъчната цялост. Този ефект се основава главно на синтеза на специфични HSPs, които са конститутивно експресирани в бъбреците и могат да бъдат силно регулирани нагоре в отговор на различни стресови състояния.4

Това проучване показва, че краткото хипертермично предизвикателство по време на изолирана бъбречна перфузия ефективно предизвиква молекулярна реакция на топлинен шок, както се вижда от предтранскрипционното и на протеиновото ниво, и активира сигнализиране за оцеляване чрез ERK пътя. По този начин описаната процедура не е свързана с видима тъканна хипоксия, въпреки изолираната перфузия без допълнителни кислородни носители.

По-рано беше установено, че индукцията на HSP може да започне в рамките на < 1 час21 и че експресията на HSP 72 се увеличава до множество още след 3 часа.22 HSP 70 е най-известният шаперон, реагиращ на хипертермичен стрес и играе ключова роля роля в защитата на тъканите чрез увеличаване на клетъчните механизми за самозащита.5

HSP 72 предотвратява неправилното нагъване на протеини,5 улеснява отстраняването на повредени протеини,6 и участва в повторното нагъване и ремонт на протеини. В подкрепа на процесите на клетъчно възстановяване, които са много по-евтини от de novo синтеза. По този начин HSP 72 намалява метаболитните нужди по време на критичната ситуация при реперфузия след клетъчно увреждане21 и по този начин помагаклетъчно възстановяванеот обида.

Стабилизирането на лизозомните мембрани23 намалява клетъчното увреждане от киселинни хидролази и последващото индуциране на клетъчна смърт. На молекулярно ниво, по-ранни проучвания показват, че HSP 72 активира пътя MEK/Erk и съответният защитен ефект е свързан с фосфорилирането на Raf, MEK и Erk и клетъчното оцеляване.24,25 Съответно, в нашия модел CH доведе до значително намаляване на общото освобождаване на AST, което се приема като параметър на общо клетъчно увреждане. Освен това, прогресивното покачване на AST по време на продължаваща реперфузия също беше значително отслабено от лечението.

Заедно с това вървеше значително смекчаване набъбречна дисфункциятъй като беше установено, че капацитетът за повторно усвояване на тубулните клетки е увеличен с ~ 50 процента спрямо контролните стойности.

HSP 27 е HSP с ниско молекулно тегло, за който също беше установено, че играе важна роля в защитния отговор на топлинен шок в бъбреците.4 Проучвания върху тубулни клетки на плъхове показват, че натрупването на HSP 27 в проксималните тубулни клетки е свързано с повишена преживяемост и регенерация.26

Въз основа на резултатите от настоящото пилотно проучване, прилагането на кратко хипертермично предизвикателство в протокола за машинна перфузия ex vivo изглежда е лесен начин за кондициониране на маргинално запазени бъбречни присадки, което насърчава устойчивостта на реперфузионно увреждане чрез подобряване на клетъчната самозащита машини. Все още съществуват противоречия дали машинната перфузия трябва да се извърши предварително, веднага след получаване на присадката27, въпреки логистичните неудобства, или ако кратък период на крайна исхемична перфузия след транспортиране на органа чрез статично хладилно съхранение би бил достатъчен и по-лесно приложим в клинична рутина.28,29 Ex vivo кондиционирането на присадката чрез CH би било възможно и при двата начина.

Трябва обаче да се внимава с преждевременните окончателни заключения. Изолираният перфузиран бъбрек (IPK) е полезен инструмент за функционални скринингови изследвания30 и корелациите между IPK данните и клиничните резултати правят IPK модела потенциално полезен инструмент за оценка на бъбречната функция.17,31 Въпреки това, сравнително постоянният функционален капацитет на модела е ограничен до няколко часа,32 което изключва дългосрочни наблюдения.

Тъй като максималната експресия на HSP все още може да настъпи след това време,22 потенциално по-нататъшно увеличаване на защитния ефект на хипертермичното лечение (напр. по отношение на подобрена регенерация след исхемичен инсулт) няма да бъде отчетено в нашата пилотна настройка. Освен това е добре известно от по-ранни проучвания в други модели, че лечението с топлинен шок или индуцираната от лентивирус свръхекспресия на HSP 27 може да доведе до смекчаване на възпалителната реактивност на увредените целеви органи

заедно със значително намаляване на неутрофилната инфилтрация в тъканта.33,34

Инфилтрацията на левкоцитите, от своя страна, е известно, че е водещо явление от остър тип, което предизвиква увреждащи възпалителни реакции след бъбречна исхемия и реперфузия in vivo.

Въпреки това, за да се изключат съпътстващите неблагоприятни ефекти от активирането на кръвни клетки върху повърхности на изкуствени тръби, което би било неизбежно в разширен in vitro модел, действителната трансплантация и реперфузия при физиологични условия, включително естествената морфология на съдовете, изглежда са задължителни за точно справяне с клетъчните възпалителни ефекти, които следователно не бяха разгледани в настоящото пилотно разследване.

Най-накрая, последните открития показаха значителниполови различияв транскрипти, експресирани в проксимални тубулни клетки на мъжки срещу женски, които могат да отразяват свързани с пола различия при хронично бъбречно заболяване или провъзпалителни генни модули.35 В нашето проучване са използвани само женски животни, като по този начин се заобикалят предполагаемите свързани с пола различия в реакции на топлинен шок. Вероятно различното поведение на мъжката тъкан, от друга страна, не е разгледано и следователно не може да бъде отчетено в това проучване.

В заключение, нашите данни досега показват, че кратката хипертермична ex vivo перфузия е лесен начин за индукция на шаперон в изолираната бъбречна присадка, която осигурява паренхимна защита при ранна реперфузия и изисква допълнително потвърждение при използване на in vivo трансплантационни модели с удължени времена на наблюдение.

Благодарности. Авторите признават с благодарност ценната техническа помощ на Bastian и Regina Lüer.

Финансиране. Не е получено финансиране за тази работа.

Конфликт на интереси. Авторите декларираха липса на конкурентни интереси в тази работа.

Авторски принос. TM и CvH са написали ръкописа. TM и CvH проектират изследването. TM и CvH извършиха изследването. TM и CvH анализираха данните.