Подобряване на паметта за изчезване чрез фармакологични и поведенчески интервенции, насочени към нейното повторно активиране

За повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Подобряване на изчезванетопаметчрез фармакологични и поведенчески интервенции, насочени към неговото повторно активиране

Josué Haubrich, Adriano Machado, Flávia Zacouteguy Boos, Ana P. Crestani, Rodrigo O. Sierra, Lucas de Oliveira Alvares & Jorge A. Quillfeldt

Изчезването е процес, който включва ново обучение, което възпрепятства изразяването на предишни придобити спомени. Въпреки че е временно ефективно, изчезването не изтрива първоначалната асоциация със страх. Тъй като следата от изчезване има тенденция да избледнява с времето, оригиналътпаметможе да възкръсне. От друга страна, укрепващите ефекти са описани в няколко проучвания за реконсолидация, използващи различни поведенчески и фармакологични манипулации. За да разберем дали паметта за изчезване може да бъде подсилена чрез интервенции, базирани на повторно активиране в контекстуалната задача за обуславяне на страха, ние започнахме с възпроизвеждане на класическия феномен на спонтанно възстановяване, за да покажем, че кратките сесии на повторно излагане могат да предотвратят разпадането на следата от изчезване с течение на времето в дълготраен начин. Показано е, че това отслабване на страха зависи както от L-тип калциеви канали, така и от протеиновия синтез, което предполага процес на реконсолидация зад индуцирания от повторното активиране укрепващ ефект. Следата от изчезване също беше податлива на усилване чрез пост-реактивираща инфузия напамет-усилващо лекарство (NaB), което също е в състояние да предотврати бързото повторно придобиване на страх (спестявания). Тези констатации сочат нови подходи, базирани на повторно активиране, способни да укрепят паметта за изчезване, за да насърчат нейното устойчивост. Конструктивните взаимодействия между изчезването и повторното консолидиране могат да представляват обещаващ нов подход в областта на лечението на разстройство, свързано със страх.

Кликнете върху Cistanche и Cistanches за памет

паметизвличането е динамичен феномен, който може, при подходящи условия, да задейства два различни процеса, повторно консолидиране или изчезване. След кратка сесия за извличане в същия контекст на обучение, преди това консолидиранпаметможе да влезе в лабилно състояние, което изисква de novo протеинов синтез, за ​​да се стабилизира отново и да продължи, процес, наречен реконсолидация1. Въпреки това, продължителните, неподсилени сесии за извличане могат да предизвикат изчезване2. Въпреки че повторното консолидиране на спомените за страх е широко проучено 3, 4, много малко проучвания досега са изследвали възможността следа от изчезване да претърпи повторна консолидация след извличане 5–7 и нейните възможни резултати и клинични приложения в момента не са проучени 8.

Изчезването намалява условните реакции чрез процес, който води до консолидиране на нов инхибиторпамет; смята се, че не е отучаване или изтриване на първоначалната следа9, 10. Терапиите, базирани на изчезване, обикновено се използват за възпрепятстване на отблъскващи реакции при пациенти с разстройства, свързани със страх, като посттравматично стресово разстройство11, 12. Въпреки че е ефективна интервенция, рецидивът често се съобщава за симптоми на страх13, което показва, че в сравнение със силните спомени за страх, изчезването е по-малко трайно и склонно към разпадане. Реакциите на страх могат лесно да се възстановят поради няколко процеса на рецидив, като спонтанно възстановяване, възстановяване, обновяване и бързо повторно придобиване14, 15. Съответно, от голямо значение е да се намерят по-добри подходи за повишаване на силата и устойчивостта на изчезване.

Въпреки че както повторното консолидиране, така и изчезването са предизвикани от извличането, те са различни процеси. От гледна точка на поведението, повторното консолидиране обикновено се извършва чрез кратки експозиции на условния стимул (CS), докато екстинкцията изисква по-дълги. В допълнение, индукцията на реконсолидация се модулира от други контекстуални и когнитивни фактори, общо известни като гранични условия16. Чрез промяна на продължителността на експозиция на CS, анамнестичният агент селективно ще наруши повторното консолидиране на оригиналната следа или консолидацията.

Психобиология и неврокомпютърна лаборатория и невробиология напаметлаборатория. Програма за висше образование по невронауки, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, PortoAlegre, Бразилия. Кореспонденцията и исканията за материали трябва да се адресират до JH (имейл: biohaubrich@gmail.com) или JAQ (имейл: quillfe@ufrgs.br) от следата за изчезване 17–23. Фактът, че и двата процеса не се извършват едновременно, предполага ефект на доминиране на следа, тъй като доминиращата следа ще бъде първата, ако не и единствената, засегната от някаква намеса. Доминиране на следи също се получава, когато преди това консолидирани следи от страх и изчезване съществуват едновременно, което засяга тяхното извличане. При такива условия повторното излагане на CS, което потенциално може да активира както следи от страх, така и следи от изчезване, ще доведе до изразяване на доминиращата памет и до инхибиране на другата2. Както беше обсъдено по-горе, първоначално изчезването е доминиращо и лесно потиска страха. Въпреки това, с времето първоначалната следа от страх преодолява инхибирането чрез изчезване и отново става доминиращо изразена14. Освен това има двойна дисоциация между двата процеса по отношение на молекулярни маркери като Zif26824, калциневрин19, 25 и BDNF26, което показва, че и двата процеса не протичат паралелно.

Често се предполага, че функционалната роля на процеса на дестабилизация-рестабилизация зад реконсолидацията е да позволипаметда се актуализира, за да запази своята предсказваща и адаптивна релевантност3, 27–29. Например,паметсъдържанието може да се актуализира чрез включване на нова информация30–34. В допълнение, няколко проучвания съобщават, че повторното консолидиране може да посредничипаметподобряване и укрепване 30, 35–39, както и затихване на паметта (без изчезване) на неприятни преживявания 34, 40 . Интересното е, че има проучвания, които показват, че при някои задачи повторното консолидиране се случва само когато паметта все още не е на асимптотично ниво41–43, което допълнително подчертава ролята му в укрепването на следата на паметта. Въпреки това, досега не е известно дали консолидирана следа от изчезване може да бъде модифицирана чрез повторна консолидация.

Повторната консолидация може да отвори прозорец, който да позволи фармакологичната модулация на реактивиранитепамет. Това би било паралелно на класически експерименти, при които вливането на амнестици след реактивиране уврежда паметта1 или поне ефективно намалява реакциите на страх при фобиите44. Освен това интервенциите след реактивиране, които насърчават реконсолидацията, могат да доведат до подобрена производителност45–47. Следователно, специфични съединения, прилагани по време на прозореца напаметлабилността по време на реконсолидация позволява положителна или отрицателна модулация напаметсила.

Като се има предвид неговото клинично значение, има значителен интерес към разработването на по-ефективни подходи, базирани на изчезване48. Спомените за изчезване са ефективни при временно потискане на реакциите на страх, но страхът се връща лесно2. Произтичащи от факта, че воденият от извличане процес на реконсолидация може да доведе допаметукрепване, или поведенчески30, 35–39, или фармакологично45–47, ние предполагаме, че ако изчезванетопаметсе активира отново, може да претърпи процес на реконсолидация и да бъде положително модулиран чрез поведенчески и фармакологични интервенции, което води до повишена резистентност към рецидив.

За да проверим това, ние оценихме ефекта от кратките повторни експозиции на кондиционирания контекст при животни, които преди това са били обучени в контекстуално кондициониране на страх (CFC) и подложени на изчезване. Ние открихме, че спонтанно възстановяване се наблюдава 2 седмици след изчезване, но периодичните сесии за повторно активиране успяха да забавят възраждането на следите от страх поне с 4 седмици. Показано е, че този ефект зависи от L-тип волтаж-зависими калциеви канали (L-VGCC) и е доказано, че реактивирането един ден след сесията на екстинкция води до това, че следата на екстинкцията временно става лабилна по начин, зависим от протеиновия синтез. Всички взети заедно, данните силно предполагат процес на реконсолидация, действащ върху следата на изчезване. Също така, в протокол, използван за изследване на бързото повторно придобиване на страх - друг процес на рецидив след изчезване49 -, еднократна инфузия на натриев бутират (NaB) след реактивиране, инхибитор на HDAC, който положително регулира пластичността на невроните50, успя да подобри изчезванепаметдо точката на съпротива на възстановяването на страха. Доказателствата показват, че следите от изчезване могат да бъдат ефективно подсилени чрез интервенции, базирани на повторно активиране.

Експеримент 1: Изчезванепаметсамо временно потиска изразяването на страха. Изчезването е ново обучение, което временно потиска придобито преди товапамет. По този начин, след изчезване, две противоположни спомени съществуват съвместно и се конкурират за изразяване. Първоначално паметта за изчезване е доминираща над следата на страха и по този начин може да попречи на нейното изразяване. Това потискане обаче не е постоянно. С течение на времето паметта за страх преодолява инхибирането на изчезване и се връщат отвратителните поведенчески реакции. Този процес се нарича спонтанно възстановяване15. Първо, ние оценихме времевия профил на спонтанно възстановяване в нашия CFC протокол. Съответно, животните бяха обусловени от страх и 24 часа по-късно бяха подложени на обучение за изчезване. На следващия ден беше проведена тестова сесия за оценка на задържането на изчезване. Втори тест беше проведен 7, 14, 21 или 28 дни по-късно, за да се оцени спонтанното възстановяване (фиг. 1A).

По време на сесията на екстинкция, нивата на замръзване намаляват с времето във всички групи, което показва придобиване на екстинкция (повторени измервания ANOVA, F(5,140)=13.625, P=0.001; Фиг. 1B) . При тест 1, животните показват ниски нива на замръзване, което показва задържане на екстинкция (фиг. 1C). За да се оцени спонтанното възстановяване, представянето при тест 1 и тест 2 беше сравнено с ANOVA с повторени измервания, което разкри значително взаимодействие на група х сесия (повторени измервания ANOVA, F(3,27)=8.085, P { {18}}.0005). Post-hoc изследването на Tukey показа, че има значително възстановяване на реакциите на страх само в групи, където тест 2 е проведен или 21 (P=0.013) или 28 дни (P=0.0002) след тест 1, но не по-рано (7 дни: P=0.999; 14 дни: P=0.969; Фиг. 1C).

Резултатите илюстрират добре описаното15 зависимо от времето спонтанно възстановяване на страхапаметслед изчезване. В нашия протокол паметта за изчезване потиска реакциите на страх за най-малко 14 дни. След 14 дни може да настъпи спонтанно възстановяване на страха. Следователно, въпреки че първоначално доминира, паметта за изчезване се разпада с времето, позволявайки възраждане на изразяването на страх.

Експеримент 2: Периодичните реактивации на следа от изчезване забавят нейното зависимо от времето разпадане (спонтанно възстановяване). В експеримент 1 открихме, че първоначално паметта за изчезване е доминираща над аверсивнатапаметследа, предотвратявайки нейното изразяване. Този ефект избледнява в по-късни моменти, когато изчезването вече не е в състояние да потисне изразяването на страх. Съобщава се, че сесиите за повторно активиране могат да доведат допаметукрепване30, 36, 39. Тъй като следата от изчезване се разпада с течение на времето, ние предвидихме, че нейното повторно активиране вероятно ще доведе до нейното укрепване, като по този начин ще се повиши неговата устойчивост и способност да потиска страха в отдалечени времеви точки.

Фигура 1. Изчезванепаметне успява да потисне трайно страха. (A) Схематично представяне на експерименталните процедури. Обусловените от страх плъхове бяха подложени на 30-минутна сесия на изчезване и бяха тествани 24 часа по-късно. Втори тест беше проведен 7, 14, 21 или 28 дни след тест 1 (N=6 /9 на група). (B) Нива на замръзване по време на сесии на изчезване. (C) Нива на замръзване по време на тестове. (*) Значителна разлика между тестове 1 и 2 (P<0.05, repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

Съответно обусловените от страх плъхове бяха подложени на обучение за изчезване, бяха тествани 1 ден по-късно и повторно тествани 28 дни по-късно за спонтанно възстановяване. В интервала между теста и повторния тест, група животни претърпяха 3-минутни сесии за реактивиране на дни 7, 14 и 21 дни след тест 1 (група за реактивиране) или останаха в домашните си клетки (контролна група; фиг. 2A) . Допълнителна група беше подложена на сесии за повторно активиране, но без обучение за изчезване (Без изчезване плюс група за повторно активиране). 7--дневният интервал между реактивациите беше избран, тъй като в този момент изчезването все още е силно изразено (Експеримент 1).

По време на обучението за изчезване животните ефективно показват зависимо от времето намаляване на реакциите на страх (F(5,110)=30.516, P=0.001; Фиг. 2B). При тест 1 имаше значителна разлика между групите (F(2,28)=8.11, P=0.002; Фиг. 2C). Post-hoc на Tukey показа, че групите за контрол и реактивиране показват подобни нива на замръзване (P=0.915) и двете показват по-ниско замръзване от групата без изчезване плюс реактивиране (P=0.007 и P { {21}}.001, съответно). По време на сесиите за повторно активиране, ANOVA с повтарящи се измервания показа значителна разлика между групите за повторно активиране и без изчезване плюс реактивиране (F(1,19)=46.63, P=0.0001) и липса на ефект от сесията (F (2,38)=2.28, P=0.116), нито взаимодействие на група x сесия (F(2,38)=1.00, P=0.376 ; Фиг. 2D). Сравнението между тест 1 и тест 2 разкрива значително взаимодействие на група х сесия (аналогичен анализ с повтарящи се измервания, F(2,28)=3.89, P=0.03). Tukey´spost-hoc показа, че страхът в групата с повторно активиране и в групата без изчезване плюс повторно активиране не се е променил от тест 1 към тест 2 (P=0.844), но е имало значително възстановяване на страха в контролната група (P=0.02). Важно е, че замразяването на групата за реактивиране е по-ниско от всички останали при тест 2 (реактивиране x контрола: P=0.007; реактивиране x без изчезване плюс повторно активиране: P=0.0001; Фиг. 2E). Това показва, че повторното активиране засилва изчезванетопамети по този начин предотврати възстановяването на страха в отдалечена времева точка. Трябва да се отбележи, че в този протокол сесиите за повторно активиране сами по себе си нямат ефект върху нивата на страх, когато не е настъпило обучение за изчезване.

Експеримент 3 - Индуцираното от повторно активиране засилване на изчезването зависи от L-VGCC. За да се предизвика повторно консолидиране,паметтрябва да се реактивира и да влезе в лабилно състояние. Предишни разработки показват, че активирането на тип волтаж-зависими калциеви канали (L-VGCC) по време на реактивиране е необходимо за дестабилизиране и тяхната блокада от нимодипин предотвратява извършването на реконсолидация51. За да оценим ролята на L-VGCC в индуцираното от реактивиране засилване на екстинкцията, ние повторихме експерименталния дизайн на последния експеримент и администрирахме нимодипин преди реактивирането (Фиг. 3А).

По време на обучението за изчезване, животните показват зависимо от времето намаляване на реакциите на страх (F(5,125)=13.55, P=0.001; Фиг. 3B). При тест 1 животните от групите с носител и нимодипин показват еднакво ниски нива на замръзване (t тест на Студент; t(25)=0.510, P=0.615; Фиг. 3C). По време на сесиите за повторно активиране имаше значително взаимодействие група х сесия (F(2,50)=7.863, P=0.001; Фиг. 3D) с животни, третирани с нимодипин, показващи повишен страх през сесиите (P=0.004), докато няма промяна в изразяването на страх при плъхове, третирани с носител (P=0.983).

При втория тест плъховете, третирани с нимодипин, показват по-високи нива на замръзване от контролите (t(25)=5.44, P=0.0001; Фиг. 3E). Сравнявайки ефективността на двете тестови сесии, ANOVA с многократни измервания установи значително взаимодействие между група и сесия (F(1,20)=7.75, P=0.006). Tukey'spost-разкри, че представянето на третирани с нимодипин животни при тест 2 е по-високо от представянето на всички други групи и сесии (P <0,001). това="" показва,="" че="" усилването="" на="" екстинкцията="" чрез="" реактивации="" изисква="" активиране="" на="">

Експеримент 4: Едно повторно активиране на следа от изчезване отваря прозорец, чувствителен към протеиновия синтез. След повторно активиране,паметможе да претърпи фаза, която изисква de novo протеиновият синтез да бъде повторно консолидиран и да продължи. По този начин, в това лабилно състояние, той е податлив на разрушаване от инхибитори на протеиновия синтез1. В предишна работа беше доказано, че изчезванетопамете податлив на реконсолидация

Фигура 2. Периодичните реактивации предотвратяват спонтанното възстановяване на изчезванетопамет. (A) Схематично представяне на експерименталните процедури. Обусловените от страх плъхове бяха подложени на 30-минутни сесии на изчезване или останаха в домашните си клетки (Без изчезване плюс група за повторно активиране: N=7). Тестът беше проведен на следващия ден и повторен тест 28 дни по-късно. В интервала между тестовете животните бяха реактивирани с 3- минути на дни 7, 14 и 21 след тест 1 или останаха в домашните си клетки (група за изчезване плюс без реактивиране: N=10; група за изчезване плюс реактивиране: N=14). (B) Нива на замръзване по време на сесии на изчезване. (C) Нива на замръзване по време на теста. (D) Нива на замръзване по време на повторно активиране. (E) Нива на замръзване по време на повторно изпитване. (*) Значителни разлики между групите (P<0.05, two-way="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

прекъсване от намеса след реактивиране в парадигмата за избягване на инхибиторите 5, 6. След използване на сесии на повторна експозиция в предишни експерименти, ние тук оценихме дали тези повторни експозиции всъщност са сесии на реактивиране, включващи набиране на протеинов синтез. Съответно, животните бяха обусловени от страх и на следващия ден една група премина обучение за изчезване (група за изчезване), докато други останаха в домашните си клетки (група без изчезване). На ден 2 след обучението всички животни претърпяха кратка 3-минутна сесия на реактивиране и веднага след това бяха инжектирани с инхибитора на протеиновия синтез циклохексимид (CHX) или неговия носител. На следващия ден животните бяха тествани (фиг. 4А).

По време на сесията на екстинкция, ANOVA с многократни измервания разкри придобиване на екстинкция (F(5,75)=24.08, P=0.001; Фиг. 4B). По време на повторното активиране, двупосочен ANOVA показва, че животните, които преди това са били изчезнали, показват по-ниски нива на замръзване в сравнение с групата без изчезване (F(1,43)=23.32, P=0. 001; Фиг. 4C). При теста двупосочната ANOVA разкри значително лекарствено взаимодействие група х (F(1,43)=22.64, P=0.001). Tukey´spost-hoc разкри, че третирани с циклохексимид животни в групата без изчезване показват по-ниски нива на замръзване от тези, третирани с носител (P=0.01), което показва, че страхътпаметбеше увредено. В групата на изчезване,

Фигура 3. Индуцираното от повторно активиране засилване на екстинкцията разчита на L-тип волтаж-зависими калциеви канали. (A) Схематично представяне на експерименталните процедури. Обусловените от страх плъхове бяха подложени на 30-минутна сесия на изчезване. Тестът беше проведен на следващия ден и повторен тест 28 дни по-късно. В интервала между тестовете, животните бяха реактивирани с 3- минути на дни 7, 14 и 21 след тест 1. Нимодипин (N=15) или неговият носител (N=12) бяха sc влива се 30 минути преди всяко повторно активиране (B) Нива на замръзване по време на сесията на екстинкция. (C) Нива на замръзване по време на теста. (D) Нива на замръзване по време на повторно активиране. (E) Нива на замръзване по време на повторно изпитване. (*) Значителни разлики между групите (P<0.05, two-way="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="" test).="" chx-treated="" animals="" showed="" higher="" freezing="" levels="" than="" vehicle-treated="" ones="" (p="0.001)," indicating="" that="" extinction="">паметбеше нарушено.

Съответно, когато не е проведено обучение за изчезване, следата на страха се дестабилизира от повторно активиране и се прекъсва от CHX. Когато спомените за изчезване и страх съществуват едновременно, възниква ефект на доминиране на следи и изчезванетопамете този, който претърпява дестабилизация, изисквайки de novo протеинов синтез, за ​​да продължи. Това откритие показва, че следата от изчезване е ефективно реактивирана, което предполага, че повторното консолидиране е механизмът, медииращ укрепването на паметта за изчезване.

Експеримент 5 – Друг процес на рецидив на следи от изчезване, бързо повторно придобиване, може да бъде фармакологично задържан с лечение след реактивиране. Съобщава се, че повторното консолидиране може да бъде подобрено чрез прилагане след реактивиране на съединения като инхибитори на HDAC, което води до повишена производителност в дългосрочен план след реактивиранепаметтест 45, 52–54. Тук попитахме дали екстинкцията може да бъде положително модулирана чрез лечение след реактивиране с инхибитора на HDAC натриев бутират (NaB). По този начин ние използвахме протокол за възстановяване, който позволява откриване на относителни промени в силата на паметта за страх и изчезване според съотношението на повторно придобиване на страх. Например, обикновено след стандартни процедури за изчезване, повторното придобиване е бързо 32, 34, но може да бъде бавно при определени обстоятелства, като обширно учене за изчезване или слабо първоначално кондициониране 14.

Обусловените от страх плъхове преминаха обучение за изчезване и сесия за повторно активиране 24 часа по-късно. Веднага след повторното активиране, NaB или неговият носител се влива (ip). През следващите четири дни животните претърпяха смесено тестване и слаба процедура за възстановяване, за да се оцени повторното придобиване на страх. Всяка сесия се състоеше от 4-минутен тест, последван от слаб удар на краката и допълнителен период от 30 s в кутията (фиг. 5A). По време на обучението за изчезване се показват животни

Фигура 4. Изчезванепаметизисква de novo протеинов синтез след неговото повторно активиране, за да продължи. (A) Схематично представяне на експерименталните процедури. Обусловените от страх плъхове бяха подложени на 30-минутни сесии на изчезване или останаха в домашните си клетки. Сесията за повторно активиране беше проведена 7 дни по-късно, последвана от тест на следващия ден. Веднага след повторното активиране животните получават ip инфузия на циклохексимид (Група на изчезване: N=10; Група без изчезване: N=14) или неговия носител (Група на изчезване: N=9; Без изчезване група: N=11). (B) Нива на замръзване по време на сесия на екстинкция. (C) Нива на замръзване по време на сесия за повторно активиране. (D) Нива на замръзване по време на тестови сесии. (*) Значителни разлики между групите (P<0.05, repeated-measures="" or="" two-way="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

зависимо от времето намаляване на реакциите на страх (F(5,110)=32.89, P=0.001; Фиг. 5B). При повторно активиране нямаше разлика между групите, които по-късно бяха инфузирани с NaB или Veh (t(22)=0.59, P=0.56; Фиг. 5C). По време на 4-те тестови сесии (завършващи със слабо възстановяване, чийто ефект беше анализиран в следния тест; Фиг. 5D), ANOVA с многократни измервания показа значително взаимодействие на лекарство х сесия (F(3,66)=4).82 , P=0.004). Post-hoc на Tukey разкрива, че по време на първия тест групите Veh и NaB са били равни по ниво на замръзване (P=0.99). Въпреки това, след една възстановителна сесия, третираните с Veh незабавно показаха повторно придобиване на страх (P=0.0002), докато третираните с NaB не (P=0.99). Групата, третирана с NaB, показа значително повторно придобиване само след три сесии за възстановяване, при тест 4 (P=0.002).

Тези резултати показват, че лечението с NaB след реактивиране е довело до изчезванепаметустойчиви на бързо повторно придобиване. Животните от групата с превозни средства лесно показаха спестявания след една слаба сесия на преквалификация.

Фигура 5. Инфузия след реактивиране на, aпамет-усилващо лекарство, също така укрепва следите от изчезване, като предотвратява бързото повторно придобиване на страх. (A) Схематично представяне на експерименталните процедури.

Обусловените от страх плъхове бяха подложени на 30-минутна сесия на изчезване. Повторно активиране се провежда 24 часа по-късно, последвано от незабавно прилагане на натриев бутират (NaB; N=12) или неговия носител (N=12). През следващите 3 дни животните претърпяха тестови сесии, завършващи с доставяне на слаб крачен удар плюс допълнителни 30 секунди контекстуално изследване (протокол за бързо повторно придобиване). Един ден по-късно беше проведен стандартен тест. (B) Нива на замръзване по време на сесия на екстинкция. (C) Нива на замръзване по време на повторно активиране. (D) Нива на замръзване по време на изпитвания. (*) Значителни разлики между групите (P<0.05, independent-samples="" t-test="" or="" repeated-measures="" anova="" followed="" by="" tukey="" post-hoc="">

Третираните с NaB животни, от своя страна, показаха спестявания само след 3 сесии за възстановяване. Това показва, че следата на изчезване може да бъде подсилена чрез фармакологични интервенции след реактивиране.

Дискусия

В настоящото изследване ние демонстрираме, че контекстуалното изчезване на страхапаметможе да се подобри чрез кратки сесии за повторно активиране. Първо, ние показахме, че след учене на изчезване, спонтанно възстановяване на страха се наблюдава 21 дни след това, но не и 14 дни или по-рано (Експеримент 1). След това открихме, че при изчезванепамете периодично реактивиран, неговият зависим от времето разпад е предотвратен и не е потвърдено спонтанно възстановяване на страха в продължение на най-малко 28 дни (Експеримент 2), ефект, за който също е показано, че се медиира от L-VGCCs (Експеримент 3). За да проверим дали протеиновият синтез е бил набиран от сесиите на повторна експозиция, ние вляхме циклохексимид след повторно активиране и наблюдавахме появата на нов прозорец на пластичност, подкрепяйки идеята, че повторното консолидиране е протичащият процес (Експеримент 4). И накрая, използвайки различен протокол, насочен към друг механизъм на рецидив на паметта за изчезване – бързо повторно придобиване (спестявания) – ние потвърдихме, че фармакологичното инхибиране на HDAC след реактивиране също е в състояние да подобри следата на изчезване, както е доказано от наблюдаваната резистентност към бързото повторно придобиване на реакция на страх.

Известно е, че загубата на условни реакции след изчезване не е постоянна55, тъй като изчезването всъщност не зависи отпаметизтриване. Вместо това, той насърчава ново обучение, което предотвратява изразяването на предишната съхранена асоциация14. Следователно спомените за изчезване и страх съществуват съвместно и се конкурират за изразяване. Това води до ефект на доминиране на следи с изчезване, потискащо изразяването на страх. Въпреки това, изчезването лесно се разпада и паметта за страха преодолява инхибирането си чрез няколко механизма за рецидив15, 20. Най-очевидният от тях е връщането на страха само с течение на времето, наречено спонтанно възстановяване15. В допълнение, паметта за страх може да се отдели от инхибирането на изчезване чрез поведенчески феномени като бързо повторно придобиване, възстановяване и подновяване14. Загниването на изчезванетопаметс течение на времето е показано в Експеримент 1. Първоначално изчезването потиска условните страхови реакции. Въпреки това, в отдалечени моменти от време този ефект изчезва, което води до спонтанно възстановяване. Бързо повторно придобиване се наблюдава в експеримент 5. Контролните плъхове бързо показват силен страх след единична слаба сесия за възстановяване. Нови методи, предназначени да заобиколят слабата устойчивост на изчезването чрез повишаване на неговата сила, потенциално биха подобрили психиатричното лечение на разстройства, свързани със страха48.

От изчезванепаметотслабва с времето и губи способността си да потиска страха15, предотвратяването на това разпадане би било от полза. В експеримент 2 открихме, че устойчивостта на паметта за изчезване може да бъде положително модулирана чрез нейното просто повторно активиране. Съответно, нямаше признаци на спонтанно възстановяване, когато животните претърпяха кратки реактивации, дори 4 седмици след обучението за изчезване. Интересното е, че повторното активиране не е увеличило реакциите на страх при животни, които не са били подложени на обучение за изчезване, както беше съобщено по-рано 30, вероятно поради ефекта на тавана. Следователно кратките сесии за повторно активиране успяха да предотвратят зависимото от времето разпадане на изчезването по дълготраен начин.

Често се предлага да се извърши реконсолидация, за да се позволипаметсъдържанието да бъде актуализирано, като се запази неговата адаптивна приложимост за по-добро насочване на бъдещо поведение. Докладите за актуализиране на паметта, управлявано от реконсолидация, показват, че това може да се случи чрез включването на нова информация 32, 34 или чрез укрепване на съществуващи асоциации 30, 35–39. Важно е да се отбележи, че дори когато укрепването е резултат от допълнително обучение от идентичен втори опит за обучение, процесът на дестабилизиране-рестабилизиране все още е необходим36. Следователно, ние предположихме, че стимулираният от реактивиране укрепващ ефект, наблюдаван в експеримент 2, може да бъде медииран от процес на реконсолидация, който обхваща зависима от реактивирането фаза на дестабилизация, последвана от фаза на рестабилизация, която изисква de novo протеинов синтез. Предишни разработки показват, че блокерът на L-VGCC нимодипин предотвратява дестабилизирането на паметта, като по този начин предотвратява повторното консолидиране51. В експеримент 3 открихме, че укрепващият ефект на реактивирането е предотвратен от L-VGCC блокера нимодипин, който подкрепя включването на реконсолидация в усилването на следата от изчезване. Нимодипинът също е замесен в увреждането на придобиването на екстинкция, както и консолидацията 56, 57. Въпреки това, в нашия експериментален протокол нимодипинът се инжектира няколко дни след провеждането на сесията на екстинкция, което прави ефектите му различни от тези, получени около първоначалното обучение на екстинкция. По този начин, независимо кой процес всъщност е блокиран – повторно консолидиране или изчезване – експеримент 3 показва, че предизвиканото от повторно активиране засилване на изчезването изисква активирането на -VGCC да се осъществи.

Реконсолидацията е процес, при който установените по-ранопаметсе активира отново и става лабилен, изисквайки de novo протеинов синтез, за ​​да продължи. За по-нататъшно разглеждане на въпроса дали сесията на реактивиране предизвиква повторно консолидиране на следата от изчезване, ние изследвахме ефекта от инхибирането на протеиновия синтез след реактивиране при животни, които са или не са преминали преди това обучение за изчезване (Експеримент 4). При животни, които не са претърпели изчезване, инхибирането на протеиновия синтез след реактивиране нарушава повторното консолидиране на контекстуалния страхпамет, което води до ниски нива на замръзване. Обратният поведенчески резултат се получава в групата, която е претърпяла изчезване: при теста, третирани с CHX животни показват високи нива на замръзване, което показва, че паметта за изчезване е била нарушена. В този експеримент, тъй като екстинкцията беше нарушена от инхибирането на протеиновия синтез след едно повторно излагане (както беше потвърдено в тест на следващия ден), не бяха изследвани допълнителни сесии на повторно излагане. Резултатите от този експеримент показват, че следата на изчезване е възпрепятствана до степен, че вече не е в състояние да потиска страха. Предишна работа 5, 7 показва, че повторното активиране не просто насърчава „допълнително обучение за изчезване“, но подтиква следата на изчезване да влезе в лабилно състояние, което изисква повторно консолидиране, за да продължи. Човек трябва да забележи, че или паметта за изчезване, или паметта за страх са били изразени по време на повторното активиране. Съответно, следата, която е доминиращо активирана от повторното активиране, е тази, дестабилизирана и по този начин нарушена от инхибирането на протеиновия синтез.

И накрая, ние оценихме дали следата на изчезване може да бъде положително модулирана чрез третиране след реактивиране спамет-усилващо лекарство. Доказано е, че няколко фармакологични агента подобряватпаметконсолидация и реконсолидация, включително инхибитори на HDAC като натриев бутират45, 52, 53. В експеримент 5 открихме, че лечението с NaB след реактивиране подобрява следата на екстинкция, позволявайки й да устои на рецидив чрез протокол за бързо повторно придобиване. Животните, третирани с NaB, показват забележителна устойчивост на спестявания след бърза процедура за повторно придобиване. Животните, третирани с носител, показаха спестявания след една слаба сесия за възстановяване, докато плъховете, третирани с NaB, изискваха 3 сесии за възстановяване, за да покажат същия ефект на възстановяване. Това показва, че дори кратка сесия на повторно активиране прави следа от изчезване податлива на подобрение чрез положителна намеса. Повишаването на екстинкцията чрез инхибиране на HDAC след реактивиране, както се съобщава тук, предполага, че същият благоприятен ефект може да бъде постигнат с други лекарства за подобряване на паметта, за да се инхибира изразяването на страх с течение на времето.

Трябва да се вземе предвид възможността зависимото от повторното активиране укрепване на изчезването да е било медиирано от допълнително изчезване вместо повторно консолидиране. Съобщава се, че дори кратките повторни експозиции на контекст могат да доведат до изчезване, когато се провеждат в отдалечени времеви точки35. Въпреки че експерименталният протокол на тази статия се различава от нашия в значителен брой аспекти, ние включихме допълнителна експериментална група, за да контролираме тази конкретна загриженост: в експеримент 2, групата „Без изчезване плюс повторно активиране“ претърпя същите три сесии за повторно активиране, но не беше подложен на сесия за изгасване. Тази група не показа отслабване на страха, нито по време на реактивации, нито при теста, различно от това, което би се очаквало при изчезване. Допълнителни доказателства идват от експеримент 4. Ако краткото излагане предизвика допълнително изчезване, тогава лечението с циклохексимид би нарушило само постепенното обучение на тази сесия, оставяйки пощадено това, което преди това е било съхранено. Въпреки това, циклохексимидът след реактивиране е нарушил следата на екстинкция, премахвайки инхибирането на страха в тест, проведен 24 часа по-късно. Разрушаването на предварително съхранена следа чрез инхибиране на протеиновия синтез след реактивиране е в съответствие с интерпретацията на повторното консолидиране. По този начин, като се има предвид сближаването на всички поведенчески и фармакологични доказателства, получени с настоящия експериментален дизайн, нашите резултати показват, че това, което се е случило по време на сесиите за повторно активиране, е процес на реконсолидация, който медиира укрепването на изчезванетопамет.

Възстановяването на страха след подходи, базирани на изчезване, е от решаващо значение за разбиране, за да се подобрят поведенческите и фармакологичните лечения на тревожни разстройства. Всъщност усилването на екстинкцията може да се счита за отличителен белег на психиатричните изследвания. Тук открихме, че кратките сесии за повторно активиране са ефективни за предотвратяване на спонтанното възстановяване на изчезнал страхпамет. Този ефект е медииран от L-VGCCs и включва протеинов синтез, което силно предполага, че повторното консолидиране е механизмът зад това укрепване. Ние също така открихме, че положителната фармакологична модулация след реактивиране е в състояние да предотврати бързото повторно придобиване на страх. Заедно тези констатации показват, че изчезването може да се възползва от интервенции, базирани на повторно активиране, насочени към повишаване на неговата сила и устойчивост. Той също така добавя към идеята, че повторното консолидиране и изчезването не са напълно отделни процеси, както често предполагат настоящите парадигми58. Поради известността на когнитивно-поведенческите терапии, базирани на изчезване, тези констатации носят релевантни прозрения както за основните, така и за клиничните изследвания.

Методи

Субекти. Използвани са мъжки плъхове Wistar от нашата разплодна колония с тегло 300–350 g на възраст 60–70 дни. Животните бяха настанени в пластмасови клетки, четири до пет на клетка, с вода и храна на разположение ad libitum. Всички експерименти бяха извършени съгласно националното законодателство и насоки за грижа за животните (Бразилски закон 11794/2008) и одобрени от Комитета по етика на университета.

Контекстуално обуславяне на страха. CFC камерата се състоеше от осветена кутия от плексиглас (25.0 ×25.0- cm решетка от успоредни 0.1- cm калибърни пръти от неръждаема стомана, разположени на разстояние 1.{{ 7}} cm един от друг). В сесията за кондициониране плъховете бяха поставени в камерата за 3- минути и след това получиха две 2- секунди 0, 7 mA крака, разделени от 30- секунди интервал. Животните бяха държани в кондиционирана среда за допълнителни 30 секунди, преди да се върнат в домашните си клетки.

паметизгасване, повторно активиране и тестови сесии. Използвани са кратки или дълги повторни експозиции на контекста, за да се предизвика реактивиране на паметта или съответно учене за изчезване. Обучението за изчезване се състоеше от 30-минутно повторно излагане на обусловения контекст и винаги се случваше 24 часа след CFC. Сесиите за повторно активиране на паметта се състоят от 3-минутно повторно излагане на обусловения контекст. В експерименти 2 и 3 бяха проведени реактивации на дни 7, 14 и 21 след тест 1. В експерименти 4 и 5 те бяха проведени 24 часа след обучението за изчезване.

Тестовите сесии се състоеха от 4-минутно повторно излагане на контекста. При експерименти 1, 2 и 3 първият тест беше проведен 24 часа след обучението за изчезване, а вторият тест беше проведен 7, 14, 21 или 28 дни по-късно, за да се оцени страхът от спонтанно възстановяване. В експерименти 4 и 5, тестовата сесия беше проведена 24 часа след повторното активиране, за да се оцени ефектът от фармакологичните манипулации след повторното активиране.

За справяне с бързото повторно придобиване (или „спестявания“; Експеримент 5), животните претърпяха 4-минутен тест, последван от слаб удар (една 2-сек 0.4 mA). След още 30 секунди те се върнаха в домашните си клетки. Тази процедура се повтаря ежедневно три пъти, последвана от допълнителен тест един ден по-късно. При тази процедура замръзването винаги се оценява преди удара на краката (който се състои от стандартна тестова сесия). Това ни позволи както да измерим производителността, така и да подложим животните на слаба сесия за възстановяване.

лекарства. Инхибиторът на протеиновия синтез циклохексимид (CHX; Sigma) се разтваря в стерилен изотоничен физиологичен разтвор с 1 процент диметилсулфоксид до концентрация от 2,2 mg/mL. Циклохексимидът или неговият носител се инжектират интраперитонеално (ip) веднага след повторното активиране. Общият инжектиран обем беше 1 ml/kg.

Антагонистът на L-тип волтаж-зависими калциеви канали (LVGCCs) нимодипин (Sigma) се разтваря в стерилен изотоничен физиологичен разтвор с 8 процента диметилсулфоксид до концентрация от 16 mg/mL. Нимодипин или неговият носител се инжектира подкожно 30 минути преди сесиите за повторно активиране. Общият инжектиран обем беше 1 ml/kg.

Натриев бутират (NaB; Sigma), инхибитор на хистон деацетилаза (HDAC), се разтваря в стерилен изотоничен физиологичен разтвор до концентрация от 0.6g/mL. Общият инжектиран обем беше 1 mL/kg интраперитонеално веднага след повторно активиране.

Анализ на данни.паметсе измерва чрез количествено определяне на поведението на замразяване и се изразява като процент от общото време на сесията. Замръзването беше отбелязано от наблюдател, който не познаваше експерименталните условия. Хомоскедастичността и нормалността на разпределението на данните бяха потвърдени съответно с теста на Левен и теста на Колмогоров-Смирнов. Сесиите на изчезване бяха анализирани с помощта на повторени измервания ANOVA. Сесиите за повторно активиране бяха анализирани с помощта на t-тест на Student, двупосочен ANOVA или ANOVA с повтарящи се измервания, последван от post-hoc тест на Tukey. Тестовите сесии бяха анализирани с помощта на t-тест на Student, двупосочен ANOVA или ANOVA с повтарящи се измервания, последван от post-hoc тест на Tukey.

справка

1. Nader, K., Schafe, GE & Le Doux, JE Спомените за страх изискват протеинов синтез в амигдалата за повторно консолидиране след извличане. Nature 406, 722–6 (2000).(2010).

3. Finnie, PSB & Nader, K. Ролята на механизмите за метапластичност в регулиранетопаметдестабилизация и реконсолидация. Neurosci. Биологично поведение. Rev. 36, 1667–707 (2012).

5. Rossato, JI, Bevilaqua, LR, Izquierdo, I., Medina, JH & Cammarota, M. Извличането предизвиква повторно консолидиране на изчезването на страхапамет. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 107, 21801–21805 (2010).

7. Eisenberg, M. & Dudai, Y. Реконсолидиране на свежа, отдалечена и изчезнала памет за страх в Медака: старите страхове не умират. Eur J Neurosci 20, 3397–3403 (2004).

8. Rosas-Vidal, L., Rodriguez-Romaguera, J., Do-Monte, F. & Anderson, R. Насочване към повторно консолидиране на спомени за изчезване: нова потенциална стратегия за лечение на тревожни разстройства. Mol. Психиатрия 20, 1264–1265 (2015).

9. Bouton, ME, Westbrook, RF, Corcoran, KA & Maren, S. Контекстуална и времева модулация на изчезване: поведенчески и биологични механизми. Biol. Психиатрия 60, 352–60 (2006).

11. Furini, C., Myskiw, J. & Izquierdo, I. Ученето за изчезване на страха. Neurosci. Биологично поведение. Rev. 47, 670–683 (2014).

13. Vervliet, B., Craske, MG & Hermans, D. Изчезване на страха и рецидив: състояние на техниката. Annu. Rev. Clin. психол. 9, 215–48 (2013). (2002).

15. Rescorla, Ra Спонтанно възстановяване. Уча. Мем. 11, 501–9 (2004).

17. Pedreira, ME & Maldonado, H. Синтезът на протеини подлежи на повторно консолидиране или изчезване в зависимост от продължителността на напомнянето. Neuron 38, 863–869 (2003).

18. Bustos, SG, Maldonado, H. & Molina, VA Разрушителен ефект на мидазолам върху повторното консолидиране на паметта на страха: решаващо влияние на периода на реактивиране и възрастта на паметта. Невропсихофармакология 34, 446–57 (2009).

19. Merlo, E., Milton, AL, Goozée, ZY, Theobald, DE & Everitt, BJ Повторната консолидация и изчезване са разединими и взаимно изключващи се процеси: поведенчески и молекулярни доказателства. J. Neurosci. 34, 2422–31 (2014).

20. Eisenberg, M., Kobilo, T., Berman, DE & Dudai, Y. Стабилност на възстановената памет: обратна корелация с доминиране на следи. Наука 301, 1102–1104 (2003).

21. Suzuki, A. et al. Реконсолидирането и изчезването на паметта имат различни времеви и биохимични характеристики. J. Neurosci. 24, 4787–95

(2004).

22. Lee, JLC, Milton, AL & Everitt, BJ Повторно консолидиране и изчезване на условния страх: инхибиране и потенциране. J. Neurosci. 26, 10051–6 (2006).

23. Flavell, CR & Lee, JL Повторно консолидиране и изчезване на апетитната павловска памет. Neurobiol Learn Mem 104, 25–31

(2013).

24. Tedesco, V., Roquet, RF, DeMis, J., Chiamulera, C. & Monfils, M.-H. Екстинкцията, приложена след извличане на паметта за слухов страх, селективно увеличава експресията на цинков пръст протеин 268 и фосфорилиран рибозомален протеин S6 в префронталния кортекс и латералната амигдала. Neurobiol. Уча. Мем. 115, 78–85 (2014).

25. de la Fuente, V., Freudenthal, R. & Romano, A. Повторна консолидация или изчезване: превключване на транскрипционния фактор при определяне на курса на паметта след извличане. J. Neurosci. 31, 5562–73 (2011).

27. Лий, JLC Реконсолидация: поддържане на релевантността на паметта. Тенденции Neurosci. 32, 413–20 (2009).

29. Nadel, L. & Hardt, O. Актуализация на системите и процесите на паметта. Невропсихофармакология 36, 251–73 (2011).

31. Forcato, C., Rodríguez, MLC, Pedreira, ME & Maldonado, H. Реконсолидацията при хората отваря декларативната памет за влизане на нова информация. Neurobiol. Уча. Мем. 93, 77–84 (2010).

32. Monfils, M.-H., Cowansage, KK, Klann, E. & LeDoux, JE Граници на изчезване-реконсолидация: ключът към постоянното отслабване на спомените за страх. Наука (80-.). 324, 951–955 (2009).

33. Hupbach, A., Gomez, R., Hardt, O. & Nadel, L. Повторно консолидиране на епизодични спомени: фино напомняне предизвиква интегриране на нова информация. Уча. Мем. 14, 47–53 (2007).

34. Haubrich, J. et al. Реконсолидацията позволява паметта за страх да бъде актуализирана до по-малко отблъскващо ниво чрез включването на апетитна информация. Невропсихофармакология 40, 315–326 (2015).

35. Inda, MC, Muravieva, EV & Alberini, CM Възстановяване на паметта и преминаването на времето: от повторно консолидиране и укрепване до изчезване. J. Neurosci. 31, 1635–43 (2011).

(2008).

37. Фукушима, Х. и др. Подобряване на паметта за страх чрез извличане чрез повторно консолидиране. Elife 2014, 1–19 (2014).

39. Forcato, C., Rodríguez, MLC & Pedreira, ME Повтарящите се процеси на лабилизация-реконсолидация укрепват декларативната памет при хората. PLoS One 6, e23305 (2011).

(2015).

41. Garcia-DeLaTorre, P., Rodriguez-Ortiz, CJ, Arreguin-Martinez, JL, Cruz-Castaneda, P. & Bermudez-Mattoni, F. Едновременни, но не независими инфузии на анизомицин в островния кортекс и амигдалата възпрепятстват стабилизирането на вкусовата памет когато се актуализира. Уча. Мем. 16, 514–519 (2009).

42. Lee, JLC Повторната консолидация на паметта медиира актуализирането на съдържанието на паметта на хипокампа. Отпред. поведение. Neurosci. 4, 168 (2010).

44. Souter, M. & Kindt, M. Внезапна трансформация на фобийното поведение след амнезиен агент след извличане. Biol Psychiatry, doi:10.1016/j.biopsych.2015.04.006 (2015).

45. Bredy, TW & Barad, M. Инхибиторът на хистон деацетилазата валпроева киселина подобрява придобиването, изчезването и повторното консолидиране на условния страх. Уча. Мем. 15, 39–45 (2008).

47. Tronson, NC, Wiseman, SL, Olausson, P. & Taylor, JR Двупосочната поведенческа пластичност на реконсолидацията на паметта зависи от амигдаларната протеин киназа A. Nat. Neurosci. 9, 167–9 (2006).

48. Fitzgerald, PJ, Seemann, JR & Maren, S. Може ли изчезването на страха да бъде подобрено? Преглед на фармакологични и поведенчески открития. Brain Res. Бик. 105, 46–60 (2014).

49. Bouton, ME, Winterbauer, NE & Todd, TP Процеси на рецидив след изчезването на инструменталното обучение: Подновяване, възраждане и повторно придобиване. поведение. Процеси 90, 130–41 (2012).

50. Gräff, J., Kim, D., Dobbin, MM & Tsai, L. Епигенетична регулация на генната експресия във физиологични и патологични мозъчни процеси. 603–649, doi:10.1152/physrev.00012.2010 (2011).

51. Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, PW & Kida, S. Активиране на LVGCCs и CB1 рецептори, необходими за дестабилизиране на реактивирани контекстуални спомени за страх. Уча. Мем. 15, 426–33 (2008).

52. Federman, N., Fustinana, MS & Romano, A. Реконсолидацията включва ацетилиране на хистони в зависимост от силата на паметта. Неврология 219, 145–156 (2012).

53. Villain, H., Florian, C. & Roullet, P. HDAC инхибирането насърчава както първоначалното консолидиране, така и повторното консолидиране на пространствената памет при мишки. Sci. Rep. 6, 27015 (2016).

54. Stefanko, DP, Barrett, RM, Ly, AR, Reolon, GK & Wood, MA Модулация на дългосрочната памет за разпознаване на обекти чрез HDAC инхибиране. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ. 106, 9447–52 (2009).

56. Flavell, CR, Barber, DJ & Lee, JLC Повторно консолидиране на поведенческата памет на спомени за храна и страх. Нац. Общ. 2, 504

(2011).

57. Cain, CK, Blouin, AM & Barad, M. L-тип Voltage-Gated калциеви канали са необходими за изчезване, но не и за придобиване или изразяване, условен страх при мишки. J. Neurosci. 22, 9113–9121 (2002).

58. Almeida-Correa, S. & Amaral, OB Лабилизация на паметта при реконсолидация и изчезване – доказателство за обща пластична система? J Physiol Paris 108, 292–306 (2014).

Благодарности

Благодарим на г-жа Zelma Regina V. de Almeida за нейното любезно и професионално техническо съдействие и на магистър по науките. Джейн Джан за нейната щедра и компетентна езикова редакция. Тази работа беше подкрепена от стипендии и грантове от CAPES (MEC), CNPq (MCT) и PROPESQ (UFRGS). Всички автори декларират, че нямат друг източник на компенсация освен основното институционално и федерално финансиране.

Авторски принос

JH проектира проучването, извърши експериментите, анализира данните и написа ръкописа. AM, FZB, APC и ROS помогнаха в експериментите и допринесоха с идеи. LOA и JAQ помогнаха за проектирането на изследването и написването на ръкописа. Всички автори са прегледали ръкописа.

Допълнителна информация

Конкуриращи се интереси: Авторите декларират, че нямат конкурентни интереси.

Бележка на издателя: Springer Nature остава неутрална по отношение на претенции за юрисдикция в публикувани карти и институционални връзки.

Отворен достъп Тази статия е лицензирана под Creative Commons Attribution 4.0 International