Благоприятните ефекти на екстракта от Cistanche Tubulosa върху подобряване на ниската чревна пропускливост на ехинакозид (ECH) и актеозид (ACT).

Контакт: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Имейл:audrey.hu@wecistanche.com

Тадатоши Таниноа, Нориаки Нагаиб и Йошинори Фунакамиб

* Факултет по фармацевтични науки, Университет Токушима Бунри, Токушима и b Факултет по фармация, Университет Кинки, Осака, Япония

Резюме

ЦелиЦелта на това проучване беше да се разгледат полезните ефекти наЦистанчеtubulosaекстрактза подобряване на ниската чревна пропускливост на ехинакозид (ECH) и актеозид (ACT).МетодиАбсорбцията на ECH и ACT в екстракт от C. tubulosa се характеризира с помощта на монослоеве от човешки чревни Caco-2 клетки с непокътнати съединения. Зависещата от транспортера на глюкоза абсорбция на ECH и ACT беше потвърдена чрез in situ чревна перфузионна техника.Ключови констатацииПривидната пропускливост (Papp) не се различава значително между интактния ECH и интактния ACT. В присъствието на флоридин, Papp на ECH и ACT при висока доза се намалява до 20 процента от съответното нелечение, но не се променя от флоретин и верапамил. Екстрактът от C. tubulosa при ниски и високи дози повишава Papp на ECH и ACT (и двете по три пъти), което води до голямото им участие в натриево-зависимата абсорбция, независима от транспортера на глюкоза. При ниска концентрация съпътстващите нива на ECH и ACT в порталната кръв са значително потиснати от флоридин.ЗаключениеДиетичните и лечебни C.tubulosaекстрактповишаването на чревната абсорбция на ECH и ACT може да служи за по-добро управление на човешкото здраве, въпреки че участието на чувствителния към флоридин транспорт трябва да бъде намалено.

Ключови думиактеозид; Caco-2 клетъчни монослоеве;Цистанчеtubulosaекстракт; ехинакозид; флоридин-чувствителен глюкозен транспортер

екстракт от Cistanche tubolosa

Въведение

Корените наЦистанчеtubulosaтрадиционно се използват за лекарства и храна. Известно е, че екстрактът от C. tubulosa притежава фармакологични ефекти при различни мозъчни заболявания, функции против стареене, метаболизма на мазнините и растежа на косата [1–4] Наскоро иридоиди, монотерпеноиди, фенилетаноидни гликозиди и лигнани са изолирани от C. tubulosa . [5,6] Фенилетаноидните гликозиди, клас полифенолни съединения, са основните химични съставки вЦистанчевидове [7], въпреки че количествата им варират при различните видове. Ехинакозид (ECH; Фигура 1) е един от основните фенилетаноидни гликозиди в Herba Cistanchis. Той се хидролизира до актеозид (ACT; наричан също вербаскозид) от ензими от бактериален произход в дебелото черво [8,9] ECH и ACT притежават благоприятната активност на хепатопротекция [10] и противовъзпалително действие [11] при гризачи. Изненадващо, силно водоразтворимият ECH подобрява поведенческите и неврохимичните резултати в миши модел на болестта на Паркинсон и инхибира активирането на каспаза-3 и каспаза-8 в невроните на церебеларните гранули.[9] Добре известно е, че кръвно-мозъчната бариера стриктно ограничава навлизането и разпространението на ксенобиотиците в мозъка от кръвта. Wu и др. [12] също показаха, че водоразтворимият ACT се разпределя бързо в мозъчните тъкани на плъхове. Следователно, ECH и ACT могат да бъдат транспортирани в мозъка, червата и черния дроб чрез специфична система(и).

Фигура 1 Химични структури на ехинакозид и актеозид.

Въпреки че има сериозни доказателства, които предполагат, че консумацията на екстракт от C. tubulosa е полезна за човешкото здраве, пропускливостта на чист ECH през Caco{{0}} клетъчни монослоеве при апикална концентрация от 8,4 ± 1,6 ug/ml е равен или по-нисък от този на парацелуларния транспортен маркер манитол.[13] Когато чист ECH се прилага перорално на плъхове (доза 1{{10}}0 mg/kg), абсорбцията е изключително бърза (Tmax, 15 минути), а максималната серумна концентрация е много ниско (Cmax, 0.61 ± 0.32 ug/ml).[14] Абсолютната бионаличност на ECH е само 0.83 процента. По подобен начин, когато клетките Caco-2 се инкубират с фенолна фракция, частично пречистена от отпадъчни води от мелница за маслини, чистото усвояване на ACT е бързо с пиково натрупване след 30 минути и обща ефективност на натрупване от 0,1 процента, осигурявайки вътреклетъчни нива от 130 pmol/mg клетъчен протеин.[15] При плъхове максималната концентрация (0,13 ± 0,03 ug/ml) на чист ACT се достига в рамките на 30 минути след перорално дозиране със 100 mg/kg [12], което предполага бърза чревна абсорбция. Оралната бионаличност на ACT, както и на ECH, е доста ниска (0,12 ± 0,04 процента), което предполага възможността за ефекти на първо преминаване в чревния тракт и черния дроб. В жлъчката на плъх, конюгатите на метилиране и глюкурониране на ECH са основните метаболити [16], въпреки че степента на чернодробния метаболизъм остава неясна. Предварително установихме, че ECH и ACT са доста стабилни в хомогенатите на чревната лигавица на плъхове и изкуствената стомашна киселина (данните не са показани). Najar и др. [17] демонстрира, че ACT инхибира активността на P-гликопротеин (P-GP)-ATPase по начин, подобен на верапамил (представителен инхибитор на P-gp), което предполага P-gp модулатор; обаче, не е сигурно дали ACT е наличен като P-gp субстрат. Интересното е, че скорошните открития на диетичните флавоноидни-D-глюкозиди показаха, че протеинът на множествена лекарствена резистентност (MRP2) маскира натриево-зависимия глюкозен транспортер (SGLT)1- медиирано поглъщане на кверцетин 4'-O- -глюкоза, [18,19], което е отговорно за много лошото усвояване. Въпреки това, много малко се знае за чувствителността на полифенолните глюкозиди към абсорбционните транспортери, включително глюкозните транспортери. Информацията за абсорбционните характеристики на кверцетин 4'-глюкозид и ECH, който бързо пропуска кръвно-мозъчната бариера, ни подтикна да изследваме чувствителното към транспортера усвояване на фенилетаноидни гликозиди в хранителния екстракт от C. tubulosa.

В това проучване ние изследвахме медиираната от глюкозен транспортер абсорбция на интактни ECH и ACT, използвайки човешки чревни Caco{1}} клетъчни монослоеве. Едновременно с това абсорбционният транспорт на ECH и ACT, съпътстващ диетичния екстракт от C. tubulosa, се характеризира с in vitro модел и in situ интестинална перфузионна система с портална кръвна проба, която може лесно да разграничи степента на абсорбция и избягването на чернодробно първо -проходно разположение.

Материали и методи

Материали

Intact ECH и ACT бяха щедри подаръци от Eishin Trading Co., Ltd (Осака, Япония). Флоридин и флоретин са закупени от Tokyo Kasei Co., Ltd. (Токио, Япония). Верапамил и р-кумарова киселина, използвани като вътрешни стандарти за анализ с високоефективна течна хроматография (HPLC), са получени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Всички други използвани химикали са с аналитичен клас и са налични в търговската мрежа.

Растителен материал и приготвяне на метаноловия екстракт

C. tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) е многогодишно паразитно растение, което расте върху корените на вида Salvadora или Calotropis и е разпространено в страните от Северна Африка, Арабия и Азия. Изсушените стъбла на C. tubulosa се стрити на прах и се екстрахират три пъти с метанол под обратен хладник в продължение на 3 часа. Изпаряването на разтворителя при понижено налягане осигурява метаноловия екстракт. Метаноловият екстракт (търговски клас, партида № 20070130;

регистрирано търговско име, Sabaku Ninnjinn Kanka) беше щедър подарък от Eishin Trading Co., Ltd чрез Muraoka и Morikawa (Kinki University, Япония), а ботаническа идентификация беше извършена от професор Jia Xiaoguang в Синдзянския институт по традиционен китайски и Етнологични лекарства.

Анализ на растителни екстракти: хроматография

Ние определихме съдържанието на ECH и ACT в екстракта от C. tubulosa (Партида № 20070130) чрез HPLC анализ, описан по-долу. Получените данни са показани в таблица 1.

Клетъчна култура

Caco{{0}} клетки, закупени от Американската колекция от типови култури (ATCC, Rockville, MD, САЩ), бяха използвани при пасажи 38–53. Те бяха отгледани в културална среда, състояща се от модифицираната на Dulbecco среда на Eagle (DMEM, Nacalai Tesque Co., Киото, Япония), допълнена с 0.1 mM неесенциални аминокиселини, 10 процента топлинно инактивиран фетален говежди серум, 100 U/ml пеницилин G и 0,1 mg/ml стрептомицин сулфат.

Транспортни изследвания

Клетките Caco-2 се посяват при плътност от 6,4 × 103 клетки/cm2 върху поликарбонатни филтри. Монослоевете бяха използвани за транспортни експерименти 21-25 дни след засяването. Интактни ECH и ACT, които са еквивалентни на тяхното съдържание вЦистанчеtubulosa екстракт(4.5 and 13.5 mg/ml) were mixed with DMEM medium containing 0.5% dimethylsulfoxide to maintain the integrity of the cell monolayer over the periods of the experiments. Intact ACT equivalent to ECH content in the extract was also dosed in the incubation medium. The extract was suspended in a DMEM medium and was centrifuged to remove insoluble components. Supernatants were loaded to the apical side. At the indicated times, an aliquot of the incubation medium was withdrawn from the basolateral side and was mixed with acetonitrile containing an internal standard for the assay. In separate experiments, phloridzin (fifinal concentration, 1 mM) and verapamil (fifinal concentration, 0.2 mM) was added to the apical side of the monolayer; however, phloretin (fifinal concentration, 0.3 mM) was treated on both sides of the monolayer. The integrity of monolayers was monitored by transepithelial electrical resistance (TEER) using Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA) before and after transport experiments. TEER values of monolayers used were >300 Ω·cm2.

In-situ чревна перфузия

Мъжки плъхове Wistar (23{{20}}–250 g) са получени от SLC Japan (Hamamatsu, Japan). Животните бяха настанени в климатизирана стая при 12-часов цикъл светлина/тъмнина за 1 седмица преди употреба. Плъховете бяха хранени със стандартна лабораторна храна (Oriental Yeast Co., Ltd., Токио, Япония) с вода ad libitum и бяха гладни една нощ преди теста. Изследването на рециркулираща перфузия in situ беше извършено съгласно модифицираната процедура, описана от Mihara et al. [20] Накратко, плъховете са анестезирани с 25% разтвор на уретан (1 mg/kg), за да се избегне понижаване на кръвното налягане. Беше направен среден коремен разрез и тънките черва бяха разкрити. Жлъчният канал беше лигиран, за да се избегне жлъчна секреция в перфузата. Цялото тънко черво като един сегмент (от дванадесетопръстника до илеума) се изплаква с нормален физиологичен разтвор при 37 градуса за 10 минути, докато измиването изглежда бистро. Стъклени тръби, свързани със силиконова тръба, след това се канюлират в двата края на тънките черва и се закрепват с конец. След това тънките черва бяха заменени в корема и канюлите бяха свързани към перисталтична помпа. Порталната вена се канюлира с полиетиленова тръба (PE10). Екстракт от C. tubulosa, достъпен в търговската мрежа, се суспендира в бикарбонатен буфер на Krebs–Henseleit (рН 7,4), за да се получи крайна концентрация от 4,5 mg/ml и се центрофугира за 10 минути при 8000 rpm, за да се отстранят неразтворимите компоненти. Супернатантата в отсъствието или присъствието на флоридин (1 тМ) се събира отново в резервоар, който се поддържа при температура от 37 ± 0,5 градуса по време на хода на експеримента. В посочените моменти се взема кръв през канюлата на порталната вена. След центрофугиране на кръвни проби, получената плазма се депротеинизира с ацетонитрил, съдържащ вътрешния стандарт, и се центрофугира при 3000 rpm. Супернатантите се изпаряват и остатъкът се разделя с подвижна фаза, състояща се от ацетонитрил и 0,5 процента оцетна киселина. Смесеният разтвор се зарежда в HPLC колона. Плъховете са използвани в съответствие с етичните процедури, следващи Насоките за грижа и използване на лабораторни животни, издадени от японското правителство и университета Кинки.

HPLC анализ

HPLC анализът беше извършен на система, оборудвана с Shimadzu SPD{{0}}A, UV детектор, Shimadzu LC-10A помпа и Shimadzu C-R4A хронотопен интегратор (Киото, Япония). ECH и ACT бяха разделени с помощта на колона Inertsil ODS (5 μm, 4.6 × 150 mm, GL Sciences Inc., Осака, Япония). Използва се подвижна фаза от ацетонитрил и 0.5 процента оцетна киселина в съотношение 15:85 (v/v) при скорост на потока 1.0 ml/min. Откриването се извършва при 334 nm.

Кинетичен анализ

Привидните коефициенти на пропускливост (Papp) бяха оценени от наклона на линейната част от времевия ход на транспорта на съединението през Caco-2 клетъчни монослоеве, както следва:

Papp{{0}} （dQ/dt）/ A1C0)

където dQ/dt е степента на пропускливост, C0 е началната концентрация на разтвореното вещество в донорната камера и A е повърхностната площ на мембраната (4,7 cm2).

При in situ изследване на чревна перфузия при плъхове, площта под кривата плазмена концентрация-време (AUC0–90) в порталната вена от нулевия момент до последното измерено е изчислена съгласно линейното трапецовидно правило.

Физикохимични свойства

Полярната повърхност и неполярната повърхност на съединенията бяха изчислени с помощта на програмата SAS (версия 0.8, Olsson, T.; Sherbukhin, V., Synthesis and Structure Administration, 1997–2001, AstraZeneca, Cary , NC, САЩ). Експериментално определени стойности на log P и pKa са получени от литературата.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани чрез еднопосочен анализ на дисперсията, последван от posthoc теста на Tukey. Стойностите на вероятността под 5 процента се считат за значими.

Резултати

Абсорбиращ транспорт на ехинакозид и актеозид през Caco-2 клетъчни монослоеве

При мишки и плъхове интактните ECH[1{{20}},14] и ACT[12,21] се прилагат перорално в дози от 100–1{{ 39}}00 mg/kg. Използваният екстракт от C. tubulosa съдържа приблизително 30 процента ECH и 15 процента ACT на доза. Тъй като екстрактът промени осмотичното налягане и рН в инкубационната среда, бяха определени концентрации от 4,5 и 13,5 mg/ml въз основа на пероралната доза (интактни съединения: 2–20 mg/20 g тяло тегло) при мишки. Екстрактът при ниски (4,5 mg/ml) и високи дози (13,5 mg/ml) съдържа съответно 2,0 и 6,1 mg за ECH и 1,0 и 3,0 mg за ACT. Приложихме количества екстракт от C. tubulosa, които бяха много по-ниски от оралните дози на ECH и ACT, докладвани при хора (препоръчителна хранителна доза екстракт: 150 mg, съдържащи приблизително 45 mg за ECH и 22,5 mg за ACT). При ниски и високи дози на непокътнати съединения, профилите на абсорбция (Фигура 2) и Papp не се различават значително между ECH и ACT като ECH еквивалент (Таблица 2). Когато екстракт от C. tubulosa във висока доза от 13,5 mg/ml беше зареден в средата, стойностите на Papp (съответно 1,27 ± 0,13 и 0,34 ± 0,03 × 10-6 cm/s) на съпътстващите ECH и ACT бяха три пъти по-високи от тези (съответно 0,38 ± 0,09 и 0,10 ± 0,03 × 10−6 cm/s) на непокътнати ECH и ACT (Таблица 2). Екстрактът, за разлика от интактните съединения, значително подобрява абсорбционния транспорт на ECH и ACT.

Фигура 2 Абсорбтивен транспорт на ехинакозид и актеозид през Caco-2 клетъчни монослоеве в трансуелна система. Беше наблюдаван апикален към базолатерален транспорт. Затворените символи са ехинакозид (кръг) и актеозид (квадрат).Цистанчеtubulosaекстракт, дозиран при ниски и високи концентрации от 4,5 (a) и 13,5 mg/ml (b). Отворените символи са непокътнат ехинакозид (кръг) и непокътнат актеозид (квадрат), съответстващи на съдържанието на ехинакозид и актеозид вЦистанчеtubulosaекстрактдозирани, респ. Интактен актеозид (отворен триъгълник) също беше зареден в средата като доза, еквивалентна на интактен ехинакозид (отворен кръг). Резултатите са дадени със стандартни отклонения (n=3).

Инхибиторен ефект на флоридин, флоретин и верапамил

To characterize the intestinal absorption of ECH and ACT, Caco-2 cell monolayers were incubated with representative inhibitors. Apical glucose transporter 1-sensitive phloridzin dramatically reduced the Papp of intact ECH and ACT to 20% of non-treatment at the high dose (Table 2). Basolateral glucose transporter (GLUT) 2-sensitive phloretin did not decrease the transport of intact ECH and ACT (Figure 3). In this study, higher concentrations (>0.3 mM) флоретин не може да се използва поради забележима клетъчна токсичност. Освен това P-gp е идентифициран като важен играч, отговорен за взаимодействието между билкови лекарства и клинично важни субстрати на P-gp. Верапамил не повишава абсорбционния транспорт на непокътнати съединения (Фигура 3).

Абсорбционният транспорт на ECH и ACT в екстракта (ниска доза) е значително инхибиран от флоридин (Таблица 2 и Фигура 4). Екстрактът при висока доза потиска чувствителното към флоридин инхибиране, въпреки че транспортирането на непокътнати ECH и ACT е по-чувствително към флоридин (Таблица 2).

Фигура 3 Ефект на флоретин и верапамил върху абсорбционния транспорт на непокътнати ехинакозид и актеозид. Апикален към базолатерален транспорт се наблюдава след прилагане на непокътнат ехинакозид, съответстващ на съдържанието на ехинакозид в 13,5 mg/ml екстракт от апикалната страна (n=3). Актеозид (затворен квадрат) е еквивалентен по дозировка на непокътнатия ехинакозид (затворен кръг) в отсъствието на инхибитори (n=3). Отворените и затворените диаманти показват транспорт в присъствието на 0.2 mM верапамил и 0.3 mM флоретин, съответно. Експериментите за инхибиране бяха проведени в два екземпляра.

Изследване на чревната перфузия in situ

В проучване in situ тествахме дали ECH и ACT в екстракт от C. tubulosa се транспортират от SGLT1, разположен от апикалната страна на тънките черва. Когато диетичният екстракт при ниска доза (4,5 mg/ml) беше перфузиран, ECH и ACT бързо се появиха в порталната кръв (Фигура 5). AUC се определя като 2702,8 ± 384,1 μm·min за ECH и 698,3 ± 197,2 μm·min за ACT. След нормализиране на AUC със съдържание от екстракт от C. tubulosa, абсорбираното количество не се различава значително между ECH и ACT. SGLT1-чувствителният флоридин, за разлика от флоретина, значително потиска абсорбционния транспорт на съпътстващия ECH (AUC, 649,4 ± 248,2 μm·min) и ACT (не е открит).

Дискусия

Някои растителни съставки са субстрати на P-gp, силно експресиран в черния дроб, червата, мозъка и бъбреците. P-gp е определящ фактор за in vivo бионаличността, разположението и разпространението на билкови лекарства, включително жълт кантарион, куркумин, ехинацея, женшен, гинко и джинджифил.[22,23] Бионаличността на генистеин{{5} }глюкозид, флавоноидно производно, също е ограничен от чревния MRP2 транспортер.[24] Ето защо, това проучване е предназначено да изследва абсорбционните свойства на ECH и ACT, съпътстващи диетични и медицински екстракти от C. tubulosa.

Поляризираните Caco{{0}} клетъчни монослоеве, както и червата [25], експресират основни чревни транспортери за ефлукс на лекарства, като P-gp, MRPs и протеин за устойчивост на рак на гърдата [26]. Доказано е, че диетичните флавоноиди на кверцетин[27] и мирицетин[28] инхибират P-gp-медиирания ефлукс както в клетъчните линии, така и при животинските модели. Верапамил, P-gp инхибитор, не променя пропускливостта на ACT и ECH през Caco-2 клетъчни монослоеве (Фигура 3), което показва, че интактните ECH и ACT не са ограничени от P-gp ефлуксната помпа. Нашите предишни проучвания показаха, че MRP2 протеините не се експресират в Caco-2 клетъчни монослоеве.[29] P-gp и MRP2-медиираният ефлукс може да бъде изключен при ECH и ACT транспорта. Някои гликозиди на кверцетин с ниска липофилност се абсорбират по-ефективно от самия кверцетин.[30] Също така е важно да се отбележи, че ACT със захарна част се разпределя бързо в мозъчните тъкани. Нашето внимание беше фокусирано върху комбинираното действие на два глюкозни транспортера в ентероцитите: SGLT в мембраната на четка и улеснен дифузионен транспорт на глюкоза (GLUT) в базолатералната мембрана. Клетъчна култура Caco-2 може да се използва като модел за изследване на чувствителни към флоретин GLUT2 и чувствителни към флоридин SGLT1 и 2 транспортери [31–34] Глюкозата се транспортира от апикалната към базолатералната страна на Caco{{27 }} монослоеве с висока скорост с Papp от 36,8 ± 1,1×10−6 cm/s.[35] Той притежава по-висок Papp от трансцелуларния транспортен маркер пропранолол (23,4 ± 2,8 × 10−6 cm/s). Както е показано в таблица 2, интактните ECH и ACT имат много по-ниско Papp от това, отчетено при глюкоза и пасивен пропранолол. Ние изчислихме логаритъма на коефициента на разпределение (октанол-вода), log P беше изчислен като -2,32 и 0.077 за ECH и ACT, съответно. Смята се, че полярните или хидрофилни съединения се транспортират по парацелуларен път (през тесни връзки). Двата фенилетаноидни гликозида, подобно на манитола, изглежда се транспортират по парацелуларен път. Въпреки това, флоридин драстично намалява абсорбционната пропускливост на непокътнати ECH и ACT (Таблица 2), което предполага, че апикален SGLT1 играе основна роля в чревната абсорбция на интактни ECH и ACT. При еквивалентна доза, по-високата хидрофобна пропускливост на ACT беше близка до пропускливостта на ECH (Фигура 2 и Таблица 2). Йошикава и др. [36] са показали, че улесняващите транспортери (GLUT 1 и 2), както и чувствителният към флоридин SGLT1, са интензивно експресирани в тънките черва. Тъй като абсорбираните количества съединения се основават на масовия баланс между поглъщането и елиминирането, ние оценихме участието на GLUT2. Глюкозата преминава през апикалните мембрани на ентероцитите чрез SGLT1 с висок афинитет и нисък капацитет и излиза през базолатералната мембрана през GLUT2 с нисък афинитет и висок капацитет. Флоретин (специфичен инхибитор на GLUT2) не премахва транспорта на непокътнати ECH и ACT (Фигура 3). Фунес и др. [37] демонстрират, че ACT силно взаимодейства с фосфатните групи на фосфолипидните мембрани. Тъй като хидроксилните групи са изобилни в ACT структурата, водородните връзки между тези групи и глицероловите полярни глави или фосфатните групи на фосфолипидите са най-вероятните взаимодействия, които могат да се осъществят. Когато непокътнатият ECH и неговият еквивалент ACT бяха инкубирани с Caco-2 монослоеве в продължение на 11 часа, клетъчното натрупване на ACT (0,24 ± 0,04 nmol/cm2) беше три пъти по-голямо от това на ECH (0,07 ± 0,01 nmol/cm2). Смятахме, че чувствителните към SGLT1- ECH и ACT бавно се преместват от ентероцитите в кръвния поток, което вероятно води до наблюдавания нисък Papp. В сравнение с високо хидрофилния ECH, ниската пропускливост на ACT може да се дължи на интеркалиране в клетъчните мембрани.

Полифенолните съединения се консумират в билкови смеси по време на тяхното клинично приложение и се предлагат в търговската мрежа като хранителни добавки. В in-vitro проучване беше показано, че абсорбцията на фенолен епикатехин не се влияе от състава на съставките на хранителните материали за напитки.[38] Обратно, продуктовите матрици на Hypericum perforatum L. влияят на транспорта на кверцетин глюкозиди (рутин и изокверцитрин) и хиперозид през Caco-2 клетки поради разликите във фитохимичния състав на матрицата и транспортните характеристики, т.е. парацелуларен трансфер и медииран от носител или активен транспорт.[39] В това проучване C. tubulosa осигурява трикратно по-висок трансепителен транспорт от интактните ECH и ACT (Фигура 2 и Таблица 2). Спекулираме, че компонентите в екстракта от C. tubulosa активират чувствителния към флоридин транспортер и/или ускоряват елиминирането на вътреклетъчните ECH и ACT. Екстрактът от C. tubulosa във високата доза изглежда значително маскира силата на чувствителния към флоридин транспорт (Таблица 2). Хранителните въглехидрати [40] и протеините [41] взаимодействат с някои полифеноли в стомашно-чревния тракт. Morikawa и др. [10] демонстрира, че пет иридоида, канканозиди AD и канканол, монотерпенов гликозид, канканозид Е, два фенилетаноидни олигогликозида, канканозиди F и G, и ацилирана олигозахар, канканоза, могат да бъдат изолирани от екстракта от C. tubulosa, използван в момента. Други съставки, включително протеини в екстракта от C. tubulosa, остават неясни. Заедно с горните спекулации, ние сме предназначени да изследваме дали други компоненти взаимодействат с SGLT1 и инхибират абсорбцията на ECH и ACT.

In-vivo experiments cannot easily distinguish between the extent of absorption and avoidance of first-pass disposition through the liver. The in-situ intestinal perfusion model has an advantage over in-vivo and in-vitro models due to the easy control of experiment parameters exclusion of the impact of other organs and maintenance of an intact intestinal blood supply.[22] The involvement of the phloridzin-sensitive glucose transporter was evaluated in an in-situ intestinal perfusion system. As shown in Figure 5, absorbed amounts of ECH and ACT concomitants in C. tubulosa extract (low dose) were greatly abolished by phloridzin, which agrees with our in-vitro data (Figure 4). Using peptides and 20 drugs passively absorbed, a good correlation is obtained between in-vivo drug absorption and the drug permeability of Caco-2 monolayers.[42] Drugs with a Papp of >1 × 10−6 cm/s се абсорбират напълно при хора, докато слабо абсорбираните лекарства и пептиди (<1% of="" dose)="" have="" papp="" values="" of=""><1 ×="" 10−7="" cm/s.="" surprisingly,="" the="" papp="" of="" the="" ech="" concomitant="" (high="" dose)="" was="">1 × 10−6 cm/s (Таблица 2), което предполага висока орална бионаличност при животни и хора. Crespy и др. [43] демонстрират, че ефлуксът при in situ изследване на чревната перфузия не се различава значително между флоридин и флоретин. Те[44] също показаха, че пероралната бионаличност на флоридин с висока чувствителност към SGLT1 е само 10 процента при плъхове. Бъдещите проучвания трябва да оценят бионаличността и ефекта на първо преминаване през черния дроб на съпътстващата ECH след перорално приложение на хранителния екстракт във висока доза. Резултатите in situ предполагат, че приемът на екстракт от C. tubulosa може да подобри ниската орална абсорбция на интактни ECH и ACT.

Фигура 4 Инхибиторен ефект на флоридзин върху абсорбционния транспорт на ехинакозид и актеозид вЦистанчеtubulosaекстракт. Беше наблюдаван апикален към базолатерален транспорт. Затворените кръгове и квадратчета са съответно ехинакозид (a) и актеозид (b) в екстракта от 4,5 mg/ml без флоридин. Затворените диаманти показват третирането с 4,5 mg/ml екстракт, включително 1 mM флоридин. Резултатите са дадени със стандартни отклонения (n=3).

Фигура 5 Времеви курсове на концентрациите на ехинакозид и актеозид в порталната кръв по време на in situ рециркулираща чревна перфузия на плъх. Символите в кръг и квадрат са съответно ехинакозид и актеозид.Цистанчеtubulosaекстрактпри концентрация от 4,5 mg/ml се перфузира в отсъствие (затворени символи) или присъствие (отворени символи) на 1 mM флоридин при 37 градуса. Резултатите са дадени със стандартни отклонения (n=3–4). *P < 0.05="" спрямо="" хранителния="" екстракт="" в="" присъствието="" на="">

Заключение

Диетичният и медицински екстракт от C. tubulosa, подобряващ чревната абсорбция на ECH и ACT, може да служи за по-добро управление на човешкото здраве, въпреки че участието на чувствителния към флоридин транспорт трябва да бъде намалено.

Декларации Конфликт на интереси

Авторът(ите) декларират(и), че нямат конфликти на интереси за разкриване.

Финансиране

Тази работа беше частично подкрепена от Центъра за високотехнологични изследвания от университета Кинки.

Благодарности

Авторите искат да благодарят на Осаму Мураока (Университет Кинки, Осака, Япония) и Тошио Морикава (Университет Кинки, Осака, Япония) за доставката наЦистанчеtubulosaекстракти чисти съставки. Ние сме много благодарни на Масахиро Иваки (Университет Кинки) за тяхната подкрепа за обучение.

Препратки

1. Tanaka J et al. Ефект наЦистанчеtubulosa екстрактвърху различни мозъчни заболявания. Хранителен стил 21 2008; 12: 24–26.
2. Tanaka J et al. Функции против стареене наЦистанчеtubulosa екстракт. Хранителен стил 21 2008; 12: 27–29.

3. Tanaka J et al. Функции за красота и растеж на косата наЦистанчеtubulosaекстракт. Хранителен стил 21 2008; 12: 29–32.
4. Tanaka J et al. Мазнино метаболизиращ ефект наЦистанчеtubulosaекстракт. Хранителен стил 21 2008; 12: 30–33.
5. Yoshizawa F et al. Съставните части наЦистанчеtubulosaШренк (Кука) f.II. изолиране и структура на нов фенилетаноиден гликозид и нов неолигнанов гликозид. Chem Pharm Bull 1990; 38: 1927–1930.
6. Yoshikawa M et al. Фенилетаноидни аминогликозиди и ацилирани олигозахари с вазорелаксираща активност отЦистанчеtubulosa. Bioorg Med Chem 2006; 14: 7468–7475.
7. Tu PF et al. Анализ на фенилетаноидни гликозиди от Herba cistanche чрез RP-HPLC. Yao Xue Xue Bao 1997; 32: 294–300.
8. Lei L et al. Метаболитна регулация на фенилетаноидни гликозиди от Herbaцистанчетав стомашно-чревния тракт на кучето. Яо Сюе Сюе Бао 2001; 36: 432–435.
9. Geng X и др. Невропротективни ефекти на ехинакозид в миши MPTP модел на болестта на Паркинсон. Eur J Pharmacol 2007; 564: 66–74.
10. Morikawa T et al. Ацилирани фенилетаноидни аминогликозиди с хепатопротективна активност от пустинно растениеЦистанчеtubulosa. Bioorg Med Chem 2010; 18: 1882–1890.
11. Paola RD и др. Ефекти на вербаскозид, биотехнологично пречистен от растителни клетъчни култури syringa Vulgaris, в модел на пародонтит при гризачи. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 707–717.
12. Wu YT и др. Определяне на актеозид вЦистанчеdeserticola и Boschniakia rossica и неговата фармакокинетика при свободно движещи се плъхове, използвайки LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 844: 89–95.
13. Матиас А и др. Изследвания на пропускливостта на алкиламиди и конюгати на кафеена киселина от ехинацея, използвайки модел на caco-2 клетъчен монослой. J Clin Pharm Therapeut 2004; 29: 7–13.
14. Jia C et al. Определяне на ехинакозид в серум на плъх чрез високоефективна течна хроматография с обърната фаза с ултравиолетово откриване и приложението му към фармакокинетиката и бионаличността. J Chromatogr 2006; 844: 308–313.
15. Cardinali A et al. Вербаскозиди от вода от маслинова мелница: оценка на тяхната биодостъпност и чревно усвояване с помощта на моделна система in vitro храносмилане/caco-2. J Food Sci 2011; 176: H48–H54.
16. Jia C et al. Метаболизъм на ехинакозид, добър антиоксидант, при плъхове: изолиране и идентифициране на неговите жлъчни метаболити. Лекарство Metab Dispos 2009; 37: 431–438.
17. Najar IA и др. Модулиране на P-гликопротеин АТФазната активност от някои фитоконституенти. Phytother Res 2009; 24: 454–458.
18. Walgren RA et al. Изтичане на диетичен флавоноид кверцетин 4'-бета-глюкозид през човешки чревни како{4}} клетъчни монослоеве чрез апикален протеин, свързан с множествена лекарствена резистентност-2. J Pharmacol Exp Ther 2000a; 294: 830-836.
19. Walgren RA et al. Клетъчно поглъщане на диетичен флавоноид кверцетин 4'-бета-глюкозидаза от натрий-зависим глюкозен транспортер SGLT1. J Pharmacol Exp Ther 2000b; 294: 837-843.
20. Михара К и др. Чревен метаболизъм при първо преминаване на еперизон при плъхове. Pharm Res 2001; 18: 1131–1137.
21. Isacchi B et al. Антихипералгетична активност на вербаскозид в два модела на невропатична болка. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 594–601.
22. Cook TJ и др. Чревна пропускливост на хлорпирифос, използвайки метода на еднопроходна чревна перфузия при плъхове. Токсикология 2003; 184: 125-133.23. Kumar YS и др. P-гликопротеин- и цитохром P-450-медиирано взаимодействие на билкови лекарства. Drug Metabol Drug Interact 2010; 25: 3–16.
24. Walle UK et al. Транспорт на генистеин- 7-глюкозид от човешки чревни CACO-2 клетки: потенциална роля за MRP2. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1999; 103: 45–56.
25. Ito K et al. Апикална/базолатерална повърхностна експресия на транспортери на лекарства и нейната роля във векторния транспорт на лекарства. Pharm Res 2005; 22: 1559–1577.
26. Laitinen L et al. Caco-2 клетъчни култури при оценката на чревната абсорбция: ефекти на някои едновременно прилагани лекарства и естествени съединения в биологични матрици. (Университет на Хелзинки, Финландия, 2006 г.) Академична дисертация, стр. 1–66.
27. Scambia G et al. Кверцетинът потенцира ефекта на адриамицин в мултирезистентна MCF-7 клетъчна линия на човешки рак на гърдата: P-гликопротеин като възможна цел. Cancer Chemother Pharmacol 1994; 34: 459-464.
28. Choi DH et al. Ефект на мирицетин, антиоксидант, върху фармакокинетиката на лосартан и неговия активен метаболит, EXP-3174, при плъхове: възможна роля на цитохром P450 3A4, цитохром P450 2C9 и P- инхибиране на гликопротеин от мирицетин. J Pharm Pharmacol 2010; 62: 908–914.
29. Tanino T et al. Паклитаксел-2′- етилкарбонатно пролекарство може да заобиколи P-гликопротеин-медиирания клетъчен ефлукс, за да увеличи цитотоксичността на лекарството. Pharm Res 2007; 24: 555–565.
30. Hollman PC и др. Абсорбция на диетични кверцетин гликозиди и кверцетин при здрави доброволци с илеостомия. Am J Clin Nutr 1995; 62: 1276-1282.
31. Kellett GL и др. Дифузионният компонент на чревната абсорбция на глюкоза се медиира от индуцираното от глюкоза набиране на GLUT2 към мембраната на четката. Biochem J 2000; 350: 155–162.
32. Matter K et al. Сортирането на ендогенните протеини на плазмената мембрана се извършва от две места в култивирани човешки чревни епителни клетки (Caco-2). Cell 1990; 60: 429–437.
33. Mahraoui L et al. Наличие и диференциална експресия на SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT3 и GLUT5 хексозни транспортни иРНК в Caco-2 клетъчни клонинги във връзка с клетъчния растеж и консумацията на глюкоза. Biochem J 1994; 298: 629–633.
34. Mesonero J et al. Зависима от захарта експресия на транспортера на фруктоза GLUT 5 в Cac-2 клетки. Biochem J 1995; 312: 757–762.
35. Walgren RA et al. Транспорт на кверцетин и неговите глюкозиди през човешки чревни епителни Caco{1}} клетки. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1721–1727.
36. Yoshikawa T et al. Сравнителна експресия на хексозни транспортери (SGLT1, GLUT1, GLUT2 и GLUT5) в стомашно-чревния тракт на мишката. Histochem Cell Biol 2011; 135: 183–194.
37. Funes L et al. Ефекти на вербаскозид, фенилпропаноиден гликозид от лимонова върбинка, върху мембрани на фосфолипиден модел. Chem Phys Lipids 2010; 163: 190–199.
38. Neilson AP et al. Влияние на състава на шоколадовата матрица върху биодостъпността на какаовия флаван-3-ол in vitro и бионаличността при хора. J Agric Food Chem 2009; 57: 9418–9426.
39. Gao S et al. Силно променливото съдържание на феноли в продуктите от жълт кантарион влияе върху техния транспорт в човешкия чревен Caco{1}} клетъчен модел: фармацевтична и биофармацевтична обосновка за стандартизация на продукта. J Agric Food Chem 2010; 58: 6650–6659.
40. Schramm DD et al. Хранителни ефекти върху абсорбцията и фармакокинетиката на какаовите флаваноли. Life Sci 2003; 73: 857–869.
41. Laurent C et al. Винената матрица без етанол и полифенол стимулира диференциацията на човешките чревни Caco-2 клетки. Влияние на тяхната връзка с богат на процианидин екстракт от гроздови семена. J Agric Food Chem 2005; 53: 5541–5548.
42. Artursson P et al. Корелация между пероралната абсорбция на лекарството при хора и привидните коефициенти на пропускливост на лекарството в човешки вътрешни епителни (Caco-2) клетки. Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 880–885.

43. Crespy V et al. Сравнение на чревната абсорбция на кверцетин, флоретин и техните глюкозиди при плъхове. J Nutr 2001a; 131: 2109–2114.

44. Crespy V et al. Бионаличност на флоретин и флоридин при плъхове. J Nutr 2001b; 131: 3227–3230.