Причината за поликистоза на бъбреците

за повече информация:ali.ma@wecistanche.com

Свръхекспресията на PKD1 причинява поликистозно бъбречно заболяване

Каролин Тивиерж, Алмира Курбегович, Мартин Куилард, Ричард Гийом, Оливие Коте и Мари Труде

Патогенетичните механизми в основатаавтозомно доминантнополикистоза на бъбреците(ADPKD) остава да бъдат изяснени. Въпреки че има доказателства, че Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)хаплонедостатъчността на гена и загубата на хетерозиготност може да причини образуване на кисти при мишки, парадоксално високи нива на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1) експресия е открита в бъбреците на ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците) пациенти. За да се определи дали Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)увеличаването на функцията може да бъде патогенетичен процес, Pkd1 бактериална изкуствена хромозома (Pkd1-BAC) е модифицирана чрез хомоложна рекомбинация, за да се насочи единствено към продължителна експресия на Pkd1 преференциално към бъбрека на възрастен. Бяха генерирани няколко трансгенни линии, които специфично свръхекспресират Pkdl трансгенът в бъбреците 2- до 15-се сгъва над ендогенните нива на Pkd1. Всички трансгенни мишки възпроизводимо развиват тубулни и гломерулни разходи и бъбречна недостатъчност и умират от бъбречна недостатъчност. Този модел демонстрира, че свръхекспресията на див тип Pkd1 сама по себе си е достатъчна, за да предизвика цистогенеза, наподобяваща човешка ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците). Нашите резултати също разкриха поразително повишена бъбречна експресия на c-myc при мишки от всички трансгенни линии, което показва, че c-myc е критичен in vivo ефектор надолу по веригата на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)molecular Dathwavs, Това проучване не само създаде безценен и първи PKD(поликистоза на бъбреците)модел за оценка на молекулярната патогенеза и терапии, но също така предоставя доказателства, че усилването на функцията може да бъде патогенетичен механизъм при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците).

Кликнете върху Cistanche за бъбречно заболяване

Автозомно доминантнополикистоза на бъбреците(ADPKD) е едно от най-често срещаните генетични заболявания при хората. Характеризира се с прогресивно развитие на множество бъбречни кисти, засягащи всички сегменти на нефрона. Други прояви включват образуването на кисти в черния дроб и панкреаса, както и интракраниални аневризми и сърдечно-съдови дефекти. ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)обикновено води до бъбречна недостатъчност с прогресия до краен стадий на бъбречно заболяване до края на средната възраст.

Приблизително 85 процента от ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)случаите са свързани с мутации в PKD1(поликистоза на бъбреците 1)ген. Този PKD1(поликистоза на бъбреците 1)генът е голям, обхваща 54 kb и се състои от 46 екзона. Той генерира 14.2-kb транскрипт и кодира 4., 302-аминокиселинен протеин, наречен полицистин-1(4, 9-11). Човешката PKD1 и експресията на полицистин-1 са анализирани при нормални и ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)бъбреци. По време на бъбречното развитие, полицистин-1 се открива лесно в гломерулни и тубулни епителни клетки (преглед в препратка 37 и препратки там). При нормални възрастни ние и други показахме, че PKD1(поликистоза на бъбреците 1)РНК и протеинът се експресират в умерени до ниски нива в събирателните и дисталните тубули, докато нивата се повишават (~2-кратно) при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)бъбреци (22, 39). Интересно е, че персистираща или засилена експресия на полицистин-1 се открива в по-голямата част от бъбречните епителни кисти, въпреки че оцветяването липсва при значителна част от кистите (29). В допълнение към бъбреците, PKD1(поликистоза на бъбреците 1)експресията обикновено е широко разпространена в други тъкани на възрастни, включително типове епителни и неепителни клетки (6,14,18,29,30, 39).

Повече от 200 различни PKD1(поликистоза на бъбреците 1)са описани мутации, повечето от които са делеция-вмъкване, изместване на рамката или безсмислени мутации. Предвижда се, че те ще доведат до съкратени форми на протеина, в съответствие с инактивирането на един алел.

Въпреки това, значителна част са missense или in-frame мутации, които се срещат в целия ген и често са уникални за конкретно семейство (33, 34). Както подсказва името, ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)е доминиращ и предаденият мутирал PKD1(поликистоза на бъбреците 1)алелът е достатъчен, за да предизвика болестта. Въпреки това, фокалната природа на бъбречните кисти при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)предполага, че мутационният механизъм за PKD1(поликистоза на бъбреците 1)може да бъде двупопадение или загуба на хетерозиготност. Подкрепа за този механизъм беше получена чрез откриването на PKD1(поликистоза на бъбреците 1)клонални соматични мутации в клетки от значителна част от кистите (3, 21, 32). Механизъм на загуба на хетерозиготност може да обясни широко вариращия фенотип, който обикновено се наблюдава в отделните семейства.

Проучвания върху мишката Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)генът може да осигури ценна представа за функцията(ите) на PKD1 поради близкото сходство между човешкия и мишия ген и генния продукт. При нормално развитие, миши Pkd1 се експресира на високи нива от стадия на морула и се открива във всички клетъчни производни на нервния гребен. включително мозъка на възрастен, аортната дъга, хрущяла и мезенхимната кондензация (16, 17). Съобщава се, че хомозиготни мутантни мишки, насочени към Pkd1 делеция, умират in utero и развиват бъбречни и панкреатични кисти (2,19, 24-26, 40). Тези предишни опити за генериране на миши модели за съжаление не предоставиха жизнеспособни животни след раждането. Независимо от това, появата на бъбречни кисти в тези хомозиготни Pkd1 мутантни мишки би била в съответствие с хипотезата за мутационен механизъм с два удара при хора, който включва мутация на зародишна линия и соматично инактивиране на нормалния алел. Въпреки това, мишки, хетерозиготни за насочената делеция на Pkd1, също показват PKD със случайни чернодробни и панкреатични кисти въпреки късното начало при възрастни, поддържайки механизъм на хаплонедостатъчност или намаляване на дозата на гена. Освен това загубата на хетерозиготност или хаплонедостатъчност може да не е единственият механизъм за ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)патогенеза. Наистина, тези механизми са в противоречие с персистиращата или засилена експресия на PKD1(поликистоза на бъбреците 1)наблюдава се при повечето човешки бъбречни кисти, освен ако не се произвеждат нефункционални протеини. Това откритие на продължителна или повишена експресия на PKD1 повдига въпроса дали усилването на функцията или свръхекспресията може да бъде оперант. За да изследваме патогенетичния механизъм за усилване на функцията на Pkd1, ние изолирахме и характеризирахме миша Pkd1 бактериална изкуствена хромозома (Pkd1-BAC), която впоследствие беше модифицирана чрез хомоложна рекомбинация в Escherichia coli за насочване на експресията на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)конкретно на бъбреците. Ние съобщаваме за производството на три трансгенни линии, които експресират Pkd1 трансгена на различни нива. Всички мишки възпроизводимо показват редица прилики с човешката ADPKD и последователно развиват ранно начало с бърза прогресия на бъбречни морфологични и функционални промени и умират от бъбречна недостатъчност до средна възраст. В допълнение, настоящото проучване описва in vivo механизъм, чрез който Pkd1 може да медиира този PKD фенотип. Тези мишки представляват първия модел на PKD, произведен от единствената бъбречна свръхекспресия на ортологичния PKD1(поликистоза на бъбреците 1)ген.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Изолиране на BAC клонове, съдържащи Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)локус. Pkd1-BAC клонинги от бактериален щам гостоприемник E. coli DH10B (RecA; RecBC) бяха изолирани от 129Sv pBelo11BAC библиотека на мишка (Research Genetics). Скринингът на BAC суперпулове беше извършен чрез PCR със следните праймери: 5 региона, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (преден Pkd1 екзон 1) и 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (обратен Pkd1 екзон 1); и 3 региона, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (преден Pkd1 екзон 39) и 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (обратен Pkd1 екзон 40). Един положителен клонинг и за двете амплификации беше идентифициран и анализиран на стандартен гел и гел електрофореза с импулсно поле (PFGE), последвано от Southern blotting. За Southern blot анализ са проектирани седем миши Pkd1 сонди: геномен екзон 1 (516 bp; нуклеотиди [nt] 1 до 516; NCBI номер за достъп U70209), геномен екзон 2-3 (220 bp), геномен екзон {{ 31}} (8479 bp), cDNA екзон 15-20 (1724 bp; nt 6455 до 8179), cDNA екзон 25-34 (1315 bp; nt 9415 до 10730), cDNA екзон 36-45 ( 1655 bp; nt 10963 до 12618) и геномен екзон 45-46 (1640 bp) (16). Няколко региона, включително BAC вмъкнати краища на този миши Pkd1-BAC, също са секвенирани и е потвърдено, че са ортоложни на човешкия PKD1 ген и съседните региони.

РЕЗУЛТАТИ

Производство на SBPkdl(поликистоза на бъбреците 1) rAc-BAC чрез хомоложна рекомбинация. За да се определи дали усилването на Pkd1 само по себе си е достатъчно за получаване на ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)фенотип, първо изолирахме геномен клонинг, съдържащ целия Pkdl ген в BAC вектор 129/Sv библиотека. Тази библиотека беше скринирана чрез PCR с два комплекта праймери за Pkd1 гена, който обхваща екзон 1 в 5'-края и екзони 39 до 40 към 3'-края (фиг.1). Идентифициран е положителен BAC клонинг за Pkd1 гена, който включва цялото съседно Tsc2 генно тяло. Вмъкването на Pkd1 беше характеризирано подробно, за да се гарантира, че геномната структура съответства на тази на ендогенния Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)ген на мишия щам 129/Sv, от който е получена вложката, и от инбредния щам C57BL/6J. Геномните карти на Pkd1 локуса в BAC и в тези инбредни щамове чрез Southern blot анализ, с четири рестрикционни ензимни смилания и седем сонди, покриващи целия Pkdl ген, изглеждат идентични без доказателства за пренареждания (фиг. 1). Този BAC съдържа ~121-kb вмъкване, включително-37 kb нагоре и -39 kb надолу по веригата на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)ген, както е определено чрез електрофореза и секвениране.

Този Pkd1-BAC клон е модифициран чрез две последователни събития на хомоложна рекомбинация в E.coli. Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)генът е маркиран в екзон 10 чрез заместване на нуклеотид (G с A), за да се създаде ново EcoRI място на позиция 2355 на cDNA картата. Тази тиха точкова мутация е произведена, за да се разграничи Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)ген и транскрипт на BAC от този с ендогенен произход. Освен това сме заменили 5'регулаторните елементи на гена Pkd1-BAC, като се възползваме от предварително идентифицираните "SB" специфични за бъбречния епител елементи от SBM (свързан с c-Myc) или SBF, свързан с c- fos) конструкт-транс-ген за ограничаване на експресията в бъбреците (36, 38) (Фиг. 2а).

Този нов SBPkd1TAc-BAC беше усвоен с Notl, уникално място, разположено непосредствено преди SB елементите, и ClaI в Tsc2 генното тяло, съкращавайки Tsc2 регулаторните елементи и 5'-половината от генното тяло, за да се гарантира липсата на Tsc2 екзогенна експресия във всички тъкани и за премахване на прокариотните BACvector последователности (фиг.1 и 2). Този 70-kb Notl-Clal линеаризиран фрагмент беше изолиран, пречистен и количествено определен за микроинжектиране на ооцити (36).

Производство и анализ на SBPkd1rAc трансгенни мишки. Четирима трансгенни основатели, носещи няколко копия на трансгена SBPkd1rAc, последователно развиват PKD(поликистоза на бъбреците). От четирите SBPkdlrAc мишки основатели, определени чрез Southern анализ, бяха установени три SBPkd1rAG трансгенни линии с две до девет копия на трансгена (Фиг. 2b). Характеризирането на целостта на трансгена в тези линии се наблюдава с 5', вътрешни и 3' сонди, както е показано чрез представителни примери на Фиг. 2b. Трансгенните линии разкриват с 5'"SB" сондата лента при 10,9 kb в съответствие с SBPkd1rAc транс-гена, който е интегриран в ориентация от глава към опашка и се разкрива с 3'пробата 7.1-kb лента (фиг. 2b). В допълнение, вътрешната сонда откри 9.4-kb ендогенна Pkd1 лента, както и 6.9-kb и 2.5-kb ленти на трансгена, дължащи се на мястото на вмъкване на EcoRI в екзон 10 (фиг. 2b). Тези мишки съдържат пълни копия на трансгена въз основа на анализа на структурата на геномно припокриване.

Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)повишаване на функцията при възрастни SBPkdlrAc трансгенни мишки. Експресията на SBPkdlrAG трансгена и Pkd1 гена е изследвана в различни органи. Количественото определяне на нивата на транскрипт от трансгенния и/или ендогенния ген се извършва чрез Northern blot анализ (Фиг.3а). Както се очакваше, трансгенните и ендогенните генни транскрипти бяха с подобна дължина (14.2 kb). Въз основа на контролната експресия на GAPDH, бъбреците от всички SBPkd1TAG миши линии имат постоянно повишена експресия на транскрипт в сравнение с нормалните нива на Pkdl в бъбреците на възрастни (n=3) на подобна възраст. Бъбречната трансгенна и ендогенна експресия за различните трансгенни линии показва диапазон от 2- до 15-кратно над контролните бъбречни ендогенни нива на Pkd1 (Фигура 3a). По-специално, трансгенна линия 39 (n {{11} })показа по-висок Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)нива от редове 3(n=3) и 41 (n =4). Освен това, нивата на експресия на Pkd1, измерени чрез Northern blot анализ, корелират с тези, получени чрез PCR в реално време, използвайки праймери в екзони 1 и 2 (Фиг. 3b).

Количественото определяне на нивата на трансгенна експресия по-специално беше извършено чрез PCR в реално време и полуколичествена RT-PCR в трите трансгенни линии в зряла възраст чрез използване на праймери в 5'-нетранслираната област (В, -глобинов промотор) и в екзон 2 на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)(фиг.3b). Експресията на SBPkdlrAc в трансгенни мишки се сравнява с S16 рибозомния протеинов генен продукт като вътрешен стандарт. Условията, използвани за полуколичествена RT-PCR амплификация, бяха в линейния диапазон. Експресията на трансген чрез PCR в реално време и полуколичествена RT-PCR последователно и специфично показва най-високата експресия в бъбрека от всички трансгенни линии в сравнение с други органи (Фиг. 3b и c). Нивата на бъбречна експресия за отделна проба са възпроизводими с която и да е от използваните техники за откриване. Най-високите нива на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)трансгенна бъбречна експресия беше измерена за линии 39 и 41. За да се проследи дали повишената Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)експресия в резултат на трансгена или ендогенния ген, същата група мишки от трите трансгенни линии беше сравнена за бъбречна Pkd1 трансгенна експресия и за бъбречна Pkd1 обща (трансгенна и ендогенна) експресия чрез PCR в реално време. Интересно е, че линии 39 и 41 по отношение на линия 3 показват, че повишената трансгенна бъбречна експресия на Pkdl е подобна или над тази на общата бъбречна експресия на Pkd1, което сочи към трансгена като специфично отговорен за тази индуцирана експресия. В различни органи (включително сърце, бял дроб, мозък, черен дроб, панкреас и далак) SBPkd1rAg трансгенът показва много слаба експресия, откривана понякога в далака и белия дроб, с малко до неоткриваема експресия в други органи (фиг. 3b). Количественото определяне чрез PCR в реално време демонстрира 10- до 1,000-кратно по-ниско ниво на трансгенна експресия в екстраренални тъкани в сравнение с бъбречната експресия (фиг. 3c). "SB" регулаторните елементи на SBPkdlrA трансгена предоставят преференциална бъбречна експресия; това специфично органно разпределение също е определено, когато се използва в трансгени, свързани с c-myc (SBM) и c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, ефектор надолу по веригата на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)сигнални пътища в SBPkdlrAc мишки. За да придобием представа за вътреклетъчния патогенетичен механизъм на SBPkdlrAg трансгенни мишки, след това се опитахме да наблюдаваме нивото на бъбречна експресия на c-myc въз основа на нашето предишно наблюдение на дерегулация на c-myc при човешки ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)бъбреци (22). Анализът на бъбреците беше извършен от трите трансгенни линии 3(n =4), 39(n =7) и 41 (n=4), както и контролите (n=4). Както е показано на Фиг. 3d, има значителна експресия на ендогенен c-myc, индуциран в SBPkd1TAG мишки по отношение на контролни мишки на подобна възраст. Интересно е, че нивото на експресия на c-myc в някои SBPkd1-c бъбреци. по-специално линия 39, достига нива, сравними с тези, наблюдавани в PKD SBM трансгенен миши модел, произведен чрез бъбречна c-myc експресия.

Бъбречни аномалии при SBPkd1raG мишки, подобни на PKD(поликистоза на бъбреците). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 за всяка линия) развиха множество тубулни (T) и гломерулни кисти (G) (Фиг. 4d, f и g). Кисти се наблюдават в тубули от кортикалните и медуларните области, както и събирателни тубули от папилата (Фиг. 4d и e). Трансгенните мишки показват тубулна епителна хиперплазия (върх на стрела), включваща както кистозни, така и не-кистозни тубули и честа хипертрофия (фиг. 4g и h), но тежестта варира между отделните мишки. Често се наблюдават интерстициална фиброза (F), периваскуларни лимфоидни инфилтрати и протеинови отливки (P) (фиг. 4d и e).

За по-точно определяне на мястото на локализация на увеличения Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)експресия в бъбреците, ние проведохме in situ хибридизация, използвайки използваната преди това екзон 36-45 сонда (16). Сигналът за хибридизация е локализиран специфично към епителните клетки, покриващи киста и хиперпластични тубули, както и гломерулни кисти. В допълнение, някакъв сигнал се наблюдава върху епитела на нецистични или леко разширени тубули, вероятно идентифициращи тубули, предопределени да претърпят бъдещи кистозни промени (фиг. 4i и j).

Бъбречният хистологичен анализ също е извършен върху трансгенни мишки при раждането (n =8), следродилния ден 10 (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}) и P45(n=3) в сравнение с отрицателни котила от същата възрастова група (n 2 до 4). Интересно е, че всички новородени трансгенни мишки показват тубулна и гломерулна дилатация спрямо контролните отрицателни котила (фиг. 4k и l), което показва, че бъбречните аномалии са започнали in utero, както се наблюдава при SBM мишки и при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)пациенти. Тубулната и гломерулната дилатация се увеличават по размер и брой с напредването на възрастта. До P35, трансгенните мишки показват по-тежка хиперплазия и доказателства за гломерулосклероза. Променени бъбречни физиологични функции при SBPkd1TAG мишки. Бъбречните физиологични функции на всички трансгенни мишки показват характеристики, подобни на PKD(поликистоза на бъбреците), докато нетрансгенните котила никога не са развили болестта. В рамките на няколко месеца след раждането, засегнатите животни развиват хронична бъбречна недостатъчност. Тези животни бяха наблюдавани за бъбречни функционални параметри чрез измерване на серумни и уринни нива, уреен азот в кръвта (BUN) и креатинин, осмотичност на урината, протеин в урината и екскреция на йони (Таблица 1). Всички мишки от трите линии в сравнение с контролите показват дефекти в концентрацията, често срещана находка при ADPKD, и следователно показват намалени концентрации на BUN в урината, креатинин, протеин и желязо. Трансгенни SBPkd1TAG основатели и потомства (n 6) от всяка линия бяха наблюдавани качествено за протеинурия върху проби от урина чрез SDS-PAGE (Фиг. 5). Мишки на възраст над 2 месеца показват неселективна протеинурия, която прогресира с възрастта. В допълнение, нивата на серумния BUN и серумния креатинин са повишени, разкривайки бъбречна недостатъчност (Таблица 2). Тъй като хроничната бъбречна недостатъчност обикновено води до промени в хематологичните параметри, те са изследвани в SBPkd1TAG трансгенни мишки на възраст от 3 до 14 месеца (Таблица 2). Тези трансгенни мишки са анемични, както се вижда от значително намаления брой червени кръвни клетки, като хемоглобинът и хематокритът достигат половината от нормалните нива. Други параметри на червените кръвни клетки, като процента на ретикулоцитите, не са засегнати, както се очаква, когато са предизвикани от бъбречен дефект. Тези животни постоянно умират от бъбречна недостатъчност на 5.9  2.8 месеца (n 42) за трансгенна линия 39 и на по-късни възрасти, 14.6 3.1 месеца (n 20) и 11 .7 6.5 месеца (n 7), съответно за редове 3 и 41.

Фиг. 1. Схематично представяне и подробен анализ на рестрикционна карта на миши Pkd1-BAC.

Модели на разграждане на геномна ДНК на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)-BAC бяха сравнени с тези на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)локус в инбредните щамове мишки 129Sv и C57Bl/6J. Произведени са седем сонди, обхващащи по-голямата част от миши Pkd1 ген:

(a) екзон 1, (b) екзон 2-3, (c) екзон 7-15, (d) екзон 15-20, (e) екзон 25-34, (f ) екзон 36-45 и (g) екзон 45-46, означен от a до g на геномния Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)представяне и върху отделни петна.

Southern blot анализ след рестрикционни смилания (BamHI, EcoRI, HindIII и KpnI) на геномна ДНК от Pkd1-BAC и миши Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)локуси показват идентични модели с всичките седем сонди. М, HindIII маркер; 129, 129/Св; C57, C57Bl/6J.

ДИСКУСИЯ

Тук докладваме изолирането и характеризирането на миши Pkd1-BAC. Този Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)генът беше маркиран и регулаторните елементи бяха заменени, за да насочат експресията специфично към бъбреците чрез две последователни събития на хомоложна рекомбинация. Трансгенни мишки, произведени с този нов SBPkd1TAG ген, показват 2- до 15-кратно увеличение на експресията на Pkd1 и възпроизводимо развиват ранни бъбречни морфологични изменения, типични за PKD. Бъбречната недостатъчност е очевидна на средна възраст и мишките умират преждевременно от бъбречна недостатъчност. Нашите резултати също показват, че механизмът на свръхекспресия на Pkd1, отговорен за този фенотип, е медииран от сигнално активиране на c-myc in vivo. Това изследване демонстрира, че усилването на функцията на миши Pkd1 в бъбреците е достатъчно, за да произведе PKD бъбречен фенотип. Тъй като мишият Pkd1 ген не се дублира, както е при хората (27), ние директно идентифицирахме и изолирахме BAC клонинг, който съдържа целия Pkd1 ген. Пълна характеристика на 129/Sv миши Pkd1-BAC, индиректно сравнение с два други инбредни щама мишки, потвърди целостта на Pkd1 локуса. Вмъкването на Pkd1-BAC съдържаше 37 до 39 kb последователности нагоре и надолу по веригата от гена Pkd1. Нашият анализ показа, че генът Pkd1 в този BAC е добросъвестен миши див тип локус, който може да послужи за по-нататъшни изследвания. Въпреки че има сериозни доказателства, че образуването на кисти при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)може да е резултат от загуба на хетерозиготност след соматично инактивиране на нормалната PKD1(поликистоза на бъбреците 1)алел (3, 21, 32), има също предполагащи доказателства за продължителна или дори повишена експресия на полицистин-1 в кистозния тубуларен епител (22, 29). Последното наблюдение повдига въпроса дали свръхекспресията на Pkd1 per se е достатъчна непосредствена причина за цистогенеза. При трансгенни мишки, носещи човешка PKD1(поликистоза на бъбреците 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 и SLC9A3R2 гени, само малка част от мишките са развили кисти и нито една не е имала откриваема трансгенна експресия в зряла възраст въпреки 30 копия на трансгена (31). При тези трансгенни мишки беше трудно да се установи ясна роля за свръхекспресията на Pkd1 в цистогенезата. Нашият модел се различава, тъй като две до девет копия от див тип само на Pkd1, без съседни гени, са интегрирани в трансгенни мишки. Тъй като генът Pkd1 има основни функции в различни органи или тъкани, както е описано за множество мишки с аблация на гена Pkd1, системната свръхекспресия на Pkd1 може да доведе до допълнителни объркващи ефекти. Следователно, ние разгледахме ролята на усилването на функцията на Pkd1, използвайки подход, който е насочен към Pkd1 конкретно към бъбреците. Чрез хомоложна рекомбинация, ние първо заместихме Pkd1 регулаторния регион нагоре по веригата с "SB" бъбречно ограничени регулаторни елементи, като по този начин предотвратихме намалената генна експресия, обикновено наблюдавана за Pkd1 в зряла възраст, както и потенциална вторична регулация на обратната връзка (36, 38). Второ, ние маркирахме мишия Pkd1 трансген (Pkd1TAG) с безшумна точкова мутация в екзон 10, но не вмъкнахме етикет на епитоп, за да гарантираме, че ще бъде произведен напълно функционален протеин от "див тип" със запазена структура и цялост. От този модифициран BAC, SBPkd1TAG фрагмент беше пречистен от Tsc2 гена и BAC вектора, за да се предотврати интерференция от Tsc2 гена, който може също да индуцира кистичен фенотип (8, 20, 28), както и да се избегне инхибиторният ефект на прокариотни последователности (5).

Четири различни SBPkd1TAG трансгенни мишки основатели и три независими линии бяха произведени със специфичен бъбречен Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)- засилена експресия. Особено поразително е пълното проникване на фенотипа в тези трансгенни мишки. Основателят на SBPkd1TAG и линиите на мишката споделят няколко физиопатологични характеристики, общи с ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците). Те включват развитието на кисти в кората, медулата и гломерулите заедно с епителна хиперплазия, интерстициална фиброза и фокално интерстициално възпаление.

Тъй като ПКД(поликистоза на бъбреците)фенотипът се наблюдава последователно при всички различни трансгенни мишки основатели и трансгенната интеграция в мишия геном е случаен феномен, фенотипът не може да бъде резултат от ефекта на хромозомната позиция, а само от повишена Pkd1 експресия. Наистина, експресията на Pkd1 трансгена във всички линии беше доказана като бъбречно ограничена, както беше наблюдавано по-рано за други трансгени, регулирани от "SB" елементите (36, 38). Освен това, тази повишена експресия на Pkd1 е причинена от трансгена, а не от индиректно ендогенно активиране на Pkd1. Следователно, нашите резултати предоставят ясни доказателства, че усилването на функцията на див тип функционален Pkd1 може да доведе до множество бъбречни кисти. Важно е, че тези SBPkd1TAG мишки представляват първия миши модел, генериран от единствената свръхекспресия на миши ортолог на човешкия PKD1 ген.

SBPkd1TAG мишките демонстрират, че Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)свръхекспресията е първичен патогенетичен механизъм на бъбречната цистогенеза. Важно е, че най-високите нива на трансгенна експресия в бъбреците изглежда корелират с прогресията и тежестта на фенотипа. Открихме също, че свръхекспресията на Pkd1 в развитието на фенотипа SBPkd1TAG е вероятно да сигнализира за активиране на c-myc in vivo. Вероятно това активиране може дори да бъде директно през C-терминалната опашка на полицистин-1, подложена на протеолитично разцепване и ядрена транслокация (7). Тъй като беше показано, че повишената бъбречна експресия на c-myc при възрастни мишки индуцира PKD, би било много последователно да се поддържа c-myc като основен ефектор надолу по веригата на Pkd1 сигнални пътища. Този резултат също корелира с нашите предишни открития за повишена експресия на c-myc в бъбреците на всички човешки ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)анализирани (22). Като цяло, тези резултати показват, че c-myc е основен медиатор на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)цистогенеза. Нашите резултати от модела за усилване на функцията на Pkd1, заедно с миши Pkd1 хаплонедостатъчност и загуба на функция, показват, че всяка дисрегулация на Pkd1 може да доведе до цистогенеза (2, 19, 23–26, 31, 40).

Тежка Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)дисбаланс при мишки, индуциран от Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)аблация или трансгенна свръхекспресия причиняват ранно начало и бързо прогресиране на бъбречни кисти и засягат голяма част от тубулите. Обратно, по-лек дисбаланс на Pkd1 като хаплонедостатъчност води до по-бавно прогресиране на PKD с повече фокални кисти. Очевидното парадоксално развитие на подобен фенотип чрез противоположна дисрегулация на полицистин-1 може да се обясни с общия резултат, а именно относителен дисбаланс на протеиновата концентрация, който може да промени образуването или функцията на активен полицистинов мултипротеинов комплекс. Взети заедно, нашите резултати и тези на други изследователи твърдят, че механизмът на образуване на кисти при ADPKD (автозомно доминантнополикистоза на бъбреците)е вероятно да възникне от три патогенетични механизма: повишаване на функцията, загуба на функция и ефекти на генната доза. Новите SBPkd1TAG мишки съставляват мощен модел на бъбречна цистогенеза, който може да предостави основни прозрения в патофизиологията на PKD(поликистоза на бъбреците), Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)пътища на сигнална трансдукция и взаимодействащи партньори. Изследването на този модел може също да доведе до разработването на нови терапевтични стратегии за възстановяване на нормалния протеинов баланс в Pkd1 мултимерния комплекс.

ПРЕПРАТКИ

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Накамото. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos и M. Trudel 2000. Генетична корекция на сърповидно-клетъчна анемия: прозрения с помощта на модели на трансгенни мишки. Нац. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S.Mulroy, S.Webb, S. Fleming, K. Brindle и R. Sandford. 2001. Сърдечно-съдови, скелетни и бъбречни дефекти при мишки с целенасочено разрушаване на Pkd1(поликистоза на бъбреците 1)ген.Proc. Natl. акад. Sci. САЩ 98:12174-12179.

3. Brasier, JL и EPHenske. 1997. Загуба наполикистоза на бъбреците(PKD1) регион на хромозома 16p13 в клетки на бъбречна киста поддържа модел на загуба на функция за патогенеза на киста. J. Clin. Разследване.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T. Watnick, GG Germino и NA Doggett.1995. Анализ на геномната последователност заавтозомно доминантно поликистоза на бъбреците(PKD1) ген предсказва наличието на богато на левцин повторение. тананикам Mol. Генет.4:575-582.

5.Chada,K,J.Magram,K.Raphael,G.Radice,E.Lacy и F.Costantini.1985. Специфична експресия на чужд -глобинов ген в еритроидни клетки на трансгенни мишки. Nature 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst, GG Germino и M.-C. Гублер.2002. Експресия на PKD1(поликистоза на бъбреците 1)и PKD2(поликистоза на бъбреците 2)транскрипти и протеини в човешкия ембрион и по време на нормалното развитие на бъбреците. Am. J. Pathol 160:973-983.

7.Chauvet, V., X. Tian, ​​H.Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo и MJ Caplan.2004. Механичните стимули предизвикват разцепване и ядрена транслокация на C края на полицистин-1. J. Clin. разследване. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson и DJ Kwiatkowski.2000. Молекулярен генетичен напредък в туберозната склероза. тананикам Генет.107:97-114. 9. Консорциум, EPKD1993. Идентифициране и характеризиране на гена за туберозна склероза на хромозома 16. Клетка 75: 1305-1315.

10. Консорциум, EPKD1994. Генът за поликистозно бъбречно заболяване 1 кодира 14 kb транскрипт и се намира в дублиран регион на хромозома 16. Клетка 77:881-894.

11. Консорциум, IPKD1995. Поликистозна бъбречна болест: пълната структура на PKD1(поликистоза на бъбреците 1)ген и неговия протеин. Клетка 81:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati и M. Trudel.2002. c-myc-индуцираната апоптоза при поликистозна бъбречна болест е независима от FasL Fas взаимодействието. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME и M. Trudel.1994. Трансгенната SAD мишка: модел на човешка сърповидноклетъчна гломерулопатия. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders и J.Zhou. 1996. Идентифициране и локализиране на полицистин, PKD1(поликистоза на бъбреците 1)генен продукт. J. Clin. разследване. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li и N.Heintz. 2002. Високоефективна модификация на бактериални изкуствени хромозоми (BACs) с помощта на нови совалкови вектори, съдържащи R6Ky произхода на репликацията. Genome Res. 12;1992-1998.