Ефективността на диетичните вторични антиоксиданти върху индуцирана експресия на CYP гени и хистологични промени в черния дроб и бъбреците на прасенца, хранени с афлатоксин В1 и охратоксин А
Feb 26, 2022
Резюме:Целта на това проучване е да се проучи потенциалът на смес от странични продукти, получени от индустрията за масло от гроздови семена и морски зърнастец, за смекчаване на вредните увреждания, причинени от охратоксин А и афлатоксин В1 в черния дроб ибъбречнаниво при прасенца след отбиване. Четиридесет кръстосани хибридни прасенца TOPIGS-40 след отбиване бяха разпределени в три експериментални групи (E1, E2, E3) и една контролна група (C) и хранени с експериментални диети в продължение на 30 дни. Основната диета се използва като контрола и съдържа нормален комбиниран фураж за стартерни прасенца без микотоксини. Експерименталните групи бяха хранени както следва: E1 — основна диета плюс смес (1:1) от два странични продукта (гроздови семена и брашно от морски зърнастец); E2—основната диета, експериментално замърсена с микотоксини (479 ppb OTA и 62 ppb AFB1); и E3—основна диета, съдържаща 5 процента от сместа (1:1) от брашно от гроздови семена и морски зърнастец и замърсена със смес от OTA и AFB1. След 4 седмици животните бяха заклани и бяха взети тъканни проби от черен дроб и бъбрек за да се извърши генна експресия и хистологичен анализ. Анализът на генната експресия показа, че когато отбитите прасенца са хранени със замърсена диета, експресията на повечето анализирани гени се регулира надолу. Сред семейството на CYP450, CYP1A2 е генът с най-висока регулация надолу. Според тези резултати в черния дроб открихме, че микотоксините предизвикват хистоморфологични промени в черния дроб ибъбреки имаше ефект върху нивото на експресия на CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1 и CYP3A29, но не открихме важни промени в нивото на експресия на гените CY4A24, MRP2 и GSTA1.
Ключови думи: прасенца; антиоксидантен ефект; фуражни добавки; микотоксини; CYP генна експресия; бъбрек; бъбречна
Въведение
Микотоксините са вторични токсични метаболити, произведени от определени щамове нишковидни гъби. Тези съединения с ниско молекулно тегло (до 500 Da) могат да замърсят различни суровини и да причинят повишен риск за здравето на хората и животните [ 1 ]. Броят на микотоксините, характеризирани и с добре известни ефекти, е относително малък поради множеството метаболити с токсичен потенциал, генерирани от гъбички [2 – 4]. Те са класифицирани в пет групи със специфични химични структури, които се срещат често във фуражите и храните: трихотецени, зеараленон, охратоксини, фумонизини и афлатоксини. Гъбичките, произвеждащи микотоксини, намиращи се в храните и фуражите, се разделят на две групи: тези, които нахлуват преди прибиране на реколтата от зърно, наречени полски гъби, и тези, които растат само след прибиране на реколтата, наречени гъби за съхранение [ 5 ]. На европейско ниво има регламенти и препоръки относно максимално допустимото ниво за шест типа микотоксини, често срещани в храната на свинете: афлатоксини, фумонизини, охратоксини, деоксиниваленол, Т2 токсин и зеараленон [6 – 8]. Сред видовете селскостопански животни прасетата са много чувствителни към микотоксини поради излагането им на фуражи на зърнена основа [ 9 ]. Метаболизмът на свинете не е ефективен при детоксикацията и отделянето на микотоксини, което увеличава риска от микотоксикоза. Тази чувствителност също варира в зависимост от възрастта, концентрацията на микотоксини във фуража и продължителността на експозиция. Черният дроб е орган, който е най-засегнат от поглъщането на тези токсини [10]. Освен това, тези токсини повишават пропускливостта на чревната епителна бариера при свине и птици, което може да създаде предразположение към некротичен ентерит [11] и намаляване на вродения имунитет.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА ФУНКЦИЯ
Афлатоксините представляват най-разпространените микотоксини, намиращи се в хранителни продукти, маслодайни семена, зърнени култури, мляко, почви, животни и хора. Всички видове афлатоксини произлизат от гъбични видове, принадлежащи към рода Aspergillus и се считат за едни от най-вредните микотоксини за животни и хора [4, 10 – 17]. Както бе споменато по-горе, при кърмещи прасенца и прасета за отглеждане, готови и разплодни прасета, основните биологични ефекти на афлатоксините са канцерогенност, имуносупресия, мутагенност, тератогенност, намалена ефективност на фуража и слабо наддаване на тегло, увреден черен дроб и променени серумни биохимични параметри [18, 19] . Тежките ефекти при свинете могат да доведат до остър хепатит, системни кръвоизливи, нефроза и смърт [20], както и намалена устойчивост на стрес [21]. Някои автори също показват, че свинете, хранени с ниски нива на афлатоксини, показват признаци на белодробен оток, намалена консумация на храна и наддаване на телесно тегло и намаляване на ензимните активности, свързани с окислителното декарбоксилиране, както и общия серумен протеин, кръвното налягане и общ брой левкоцити [18, 22 – 24]. В този контекст, съгласно Директива 2003/100/EC на Европейската комисия, максимално допустимото ниво на афлатоксин B1 (AFB1) за прасета е определено на 0,02 mg/kg. Охратоксините са вторични метаболити, произведени от гъбични видове, принадлежащи към рода Aspergillus и Penicillium. Публикувани са различни мнения относно генотоксичните или негенотоксичните механизми на токсичността на охратоксините [25, 26]. In vitro и in vivo проучвания разкриват, че гуанин-OTA-специфичните ДНК адукти персистират повече от 16 дни прибъбречнаниво, докато в черния дроб и далака те бяха отстранени след 5 дни [27]. Поради това основното им токсично и канцерогенно действие се проявява вбъбрек[28].
Повечето метаболити на охратоксини от фаза I и фаза II на детоксикация имат ниска токсичност. В стомаха част от охратоксините се хидролизира до охратоксин от протеолитични ензими. Друга възможност за тяхната хидролиза е отварянето на лактонния пръстен при алкални условия на червата, като по този начин се получава съединение с висока токсичност. Поради силното свързване с албумина, елиминирането на охратоксини чрез гломерулна филтрация е незначително, като екскрецията се осъществява главно чрез тубулна секреция. Тубулната резорбция се счита за частично отговорна за вътреклетъчното натрупване на охратоксини [29,30]. Обикновено при селскостопанските животни охратоксините се абсорбират бързо след поглъщане през стомашно-чревния тракт (стомаха и проксималната част на йеюнума) по пасивен начин, което се благоприятства от високия афинитет на свързване на охратоксините с плазмените протеини, и в нейонизирана форма , което обяснява тяхната устойчивост в организма. В свинския серум охратоксините се свързват по-специфично с протеини с молекулна маса под 20 kDa, което им позволява да преминат през гломерулната базална мембрана и да проявят нефротоксични ефекти. Охратоксините се натрупват и в черния дроб и мускулите. Въпреки това,бъбрециса основното място за съхранение на охратоксини, като тяхната реабсорбция в проксималните и дисталните тубули допринася за устойчивостта на тялото и повишената нефротоксичност [27,31]. От друга страна, след като AFB1 се абсорбира на чревно ниво, той достига до черния дроб, където се трансформира от Фаза I метаболизиращи ензими чрез хидроксилиране, хидратиране, деметилиране и епоксидиране. Първите три реакции генерират нетоксични метаболити, докато четвъртата произвежда AFB1-8,9 епоксид, който образува адукти с ДНК в N7 мястото на гуанина [32]. Също така, AFB1 може да бъде конюгиран с редуциран глутатион в реакция, катализирана от глутатион-S-трансферази [33] и глюкуронова киселина [34]. Екскрецията на AFB1 се осъществява предимно през жлъчните пътища, последвани от уринарния път [35].
Една от основните трудности, срещани при контролирането на микотоксините, е наличието на повече от един вид микотоксини в партида фураж или зърнена култура по едно и също време. По този начин храненето на прасенца и прасета със замърсен фураж с няколко вида микотоксини, дори ако те са в минимални концентрации, може да причини многобройни негативни последици поради техния синергичен ефект [ 36 – 40 ]. В този контекст, намаляването и елиминирането на отрицателните ефекти на микотоксините, открити в храната за свине, може да намали производствените разходи и загубите в свиневъдството. Към днешна дата са разработени многобройни стратегии за предотвратяване, намаляване или дори елиминиране на замърсяването с микотоксини от храна за животни чрез биологични, химични и физични методи на детоксикация. Тези методи позволяват разграждането на микотоксините и съответните им метаболити и поддържат хранителната стойност на храната, без да въвеждат други вещества с токсичен потенциал в биологичните системи [6,14,41]. Биологично обеззаразяване на микотоксини чрез конкурентно инхибиране от други гъбични щамове или добавяне на антиоксидантни съединения в храната за животни, за да се намалят токсичните ефекти на микотоксините и/или да се инхибира растежа на микотоксин-продуциращи гъбични видове представлява добро решение. Най-използваният метод за противодействие на отрицателното въздействие на микотоксините върху селскостопанските животни е добавянето на "свързващи вещества за микотоксини" или "модификатори на микотоксини", които са алуминосиликати с пореста структура, способни да адсорбират и улавят микотоксини [42 – 44]. Те са много ефективни за афлатоксини и имат ограничена активност срещу други видове микотоксини. Въпреки това, тъй като са неспецифични, те също така свързват витамини и микроелементи, генерирайки дефицити [45 – 47]. Добавянето на някои растителни антиоксиданти във фуража може да бъде по-добро решение [48] за намаляване на вредните ефекти на микотоксините върху здравето на животните.
P450 цитохромни ензими, присъстващи главно в черния дроб, чревния тракт ибъбрек,играят важна роля във фаза I биотрансформация на ксенобиотици, особено тези, принадлежащи към семейства 1 и 3 [49]. Микотоксините могат да бъдат субстрати, инхибитори или индуктори на тези метаболизиращи ензими. Промените в специфичната активност и индуцируемостта на цитохромите P450 в крайна сметка ще определят относителната промяна в метаболизма на ксенобиотика. Микотоксините могат да променят генната експресия на тези протеини, което води до променена абсорбция и биотрансформация на хранителни вещества и други субстратни лекарства от фуража. Поради това, целта на настоящото проучване беше да се проучи потенциалът на смес от странични продукти, получени от маслодайна промишленост Vitis vinifera (гроздови семена) и Hippophae rhamnoides (морски зърнастец), за смекчаване на вредните щети, причинени от съпътстващото присъствие на охратоксин А (OTA) и афлатоксин В1 (AFB1) във фуража при чернодробната ибъбречнаниво при прасенца след отбиване.
Резултати
Състав на диетатаХимическият състав на брашното от странични продукти показва, че брашното от морски зърнастец е по-богато на протеини (плюс 38,4 процента), мазнини (плюс 66,6 процента) и въглехидрати и по-ниско съдържание на пепел от брашното от гроздови семки (Таблица 1).
Химическият анализ също показа различен профил на двата странични продукта в мастни киселини, флавоноиди, фенолни киселини и минерали. По този начин брашното от морски зърнастец има по-високо съдържание на наситени мастни киселини (палмитинова и палмитолеинова), омега-9 киселини (цис олеинова киселина) и омега-3 киселини (-линоленова киселина), отколкото брашното от гроздови семки . За разлика от това брашното от гроздови семки има много високо съдържание на омега-6 киселини (линолова киселина) (67,35 процента в сравнение с 18,59 процента в брашното от морски зърнастец) (Таблица 2).
И двата странични продукта съдържат флавоноиди и фенолни киселини, биоактивни съединения, известни със своите антиоксидантни, противовъзпалителни и имуномодулиращи свойства [50, 51]. Така общата концентрация на полифеноли е 74,8 процента по-висока в брашното от гроздови семки (133,84 mg GAE/L), отколкото в морския зърнастец (76,57 mg GAE/L). Що се отнася до различните класове полифеноли, брашното от гроздови семки съдържа по-висока концентрация на катехин и ванилова киселина от морския зърнастец, докато морският зърнастец е по-богат на рутин, кверцитрин, лутеолин, р-кумарова киселина и ферулинова киселина (Таблица 3). Що се отнася до минералния състав, брашното от морски зърнастец има по-високо съдържание на K, Mg, Fe, Mn и Zn, отколкото брашното от гроздови семки. Обратно, брашното от гроздови семки съдържа два пъти повече мед от брашното от морски зърнастец. Трябва да се отбележи високата концентрация на желязо от брашно от морски зърнастец (Таблица 4).
Изпълнение на животните
Излагането на прасенца от група Е2 на смес от охратоксин плюс афлатоксин В1 няма неблагоприятни ефекти върху телесното тегло, наддаването на тегло и приема на храна, тъй като разликите не са значими в сравнение с контролата. Обратно, прилагането на диета, съдържаща само сместа от странични продукти (Е1), повишава значително телесното тегло на прасенцата, хранени с тази диета, в сравнение с контролата (32,14 ± 1,63 спрямо 27,09 ± 1,31) и с група Е2, която е била хранена със замърсени диета (32,14 ± 1,63 срещу 28,72 ± 1,07). Трябва да се отбележи, че групата от прасенца, получаващи замърсен фураж и сместа от странични продукти, има тенденция да наддава на тегло в сравнение с групата от интоксикирани с микотоксини прасенца, въпреки че разликата не е значителна. Анализ на биохимичните показатели, които характеризират общото здравословно състояние на животните и функционалността на черния дроб ибъбреци, регистрирани нормални стойности за възрастовата и тегловната категория на отбитите прасенца. Не са установени значими разлики между групите за повечето от тях (Таблица 5). Въпреки това, сместа от микотоксини повишава ALP и гама GT активността в сравнение с контролата и намалява активността в контролното ниво в група Е3, получаваща сместа от странични продукти.
Хистология на черния дроб и бъбрецитеСветлинен микроскопски анализ на черния дроб от група E2, хранени с основна диета, замърсена със смес от OTA и AFB1, показва фокални области на некроза, дилатация на синусоида и възпалителна паренхимна инфилтрация. Порталните зони разкриват мононуклеарна клетъчна инфилтрация и перипортална фиброза. Фиброзните перилобуларни фиброзни прегради също бяха забелязани (Фигура 1)
Прилагането на микотоксин предизвиква структурни промени вбъбрецикоито засягат както кората, така и медулата. Забелязва се атрофия на гломерулните снопчета и промяна на капсулата на Bowmann (Фигура 2). Тубулите показват некроза на покриващи епителни клетки с инфилтрация на възпалителни клетки между тях. Фокални агрегати от възпалителни клетки се наблюдават между гломерулите и тубулите във връзка с фокалните области на конгестия в кръвоносните съдове, особено в медуларната област. Очевидно пролиферацията на колаген се наблюдава главно в области на тубулно увреждане. Освен това,бъбрексекции от групите E3, групата, хранена с основна диета, съдържаща смес от брашно от гроздови семена и морски зърнастец и замърсена със смес от OTA и AFB1, разкрива незначителни патоморфологични промени, почти подобни на контролата.
В черния дроб генната експресия за CYP1A2 намалява съответно с 18 процента за E2 и 44 процента за E3 в сравнение с групата E1. Генната експресия на CYP2A19 е немодифицирана в групи Е1 и Е2, докато в група Е3 тя намалява с почти 62 процента. Наблюдава се значително увеличение с 29 процента в генната експресия на CYP2E1 в групата Е1, хранена с основна диета, допълнена със смес от гроздови семена и брашно от морски зърнастец, в сравнение с групата Е2. За разлика от това, прилагането на основна диета, обогатена със смес от брашно от гроздови семена и морски зърнастец (група E1), понижава експресията на ген CYP3A29 с 24 процента в сравнение с нивото на групата E2. Друг контраст се наблюдава при генната експресия на CYP4A24, с 33% намаление за E1 групата и 24% намаление за E3 групата и значително увеличение от 41% в E2 групата, хранена с основна диета, допълнена със смес от AFB1 и OTA, в сравнение с контролното ниво. В случая на MRP2 моделът на генна експресия е подобен на този на гена CYP4A24, с незначително намаление от 35% за групата Е1 и 24% намаление за групата Е3 и значително увеличение от 28% в групата Е2, в сравнение до контролното ниво. Подобно на генната експресия на CYP4A24, генната експресия на GSTA1 показва значително увеличение от 14 процента в групата Е2, 9 процента увеличение в групата Е1 и 30 процента намаление за групата Е3. Очевидно, едновременното приложение на сместа от брашно от гроздови семена и морски зърнастец и OTA и AFB1 генерира намаляване на експресиите на всички анализирани гени в черния дроб в сравнение с контролата. По отношение на нивото на експресия на тези гени вбъбреци,в сравнение с чернодробни проби не са наблюдавани статистически значими промени (Фигура 4). Могат обаче да се наблюдават промени в регулирането на нивото на генна експресия.
Анализирайки фигура 4, може да се забележи, че сместа от гроздови семена и брашно от морски зърнастец регулира надолу генната експресия на CYP1A2 и повишава нагоре генната експресия на CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29 и CYP4A24 по незначителен начин, докато генната експресия на MRP2 и GSTA1 остава непроменена . Също така, наличието на OTA и AFB1 в храната на прасенцата намалява експресията на CYP1A2 и CYP2A19 гена по незначителен начин, докато MRP2 и GSTA1 са немодифицирани. Едновременното прилагане на сместа от брашно от гроздови семена и морски зърнастец и OTA и AFB1 определя връщането на нивата на експресия на всички гени до контролните нива с изключение на GSTA1, което представлява значително увеличение в сравнение с групата E1.
Дискусия
Микотоксини като AFB1 и OTA са естествени токсини, замърсяващи голямо разнообразие от растителни продукти. Като следствие, AFB1, OTA и техните метаболити присъстват в храните и фуражите, както и в продуктите от животински произход [52]. Повечето от токсикологичните изследвания относно ефектите на микотоксините разглеждат излагането на един вид микотоксин, без да вземат предвид комбинацията и взаимодействието между тях, съответно синергичните или антагонистични ефекти, които често се срещат в природата. Данните относно токсичните ефекти на комбинациите от микотоксини са ограничени, така че рисковете от излагане на няколко вида токсини все още не са известни. Появата на микотоксини като AFB1, DON, ZEA, OTA, FB1 и FB2 в зърнени храни, зърнени продукти и допълващи и пълноценни фуражи за прасета [ 16 ] е свързана с географското местоположение и изменението на климата, което увеличава свързания риск с микотоксиново замърсяване по време на съхранение и обработка на фуражни продукти за свине [53]. Съвместното заразяване на зърнени култури и други суровини се случва по-често в реалния живот, отколкото единично замърсяване с микотоксин [ 7 ]. Например, съвместната поява на афлатоксин В1 и охратоксин А е открита в различни хранителни или фуражни съставки, като пшеница [54], ечемик [55], зърнени брашна [56], подправки [57] и др. между AFB1 и OTA във фуража е установено, че е около 1 до 6 [37]. Също така, глобалното захранващо съдържание в AFB1 и OTA варира съответно между неопределено и 100 ppb и неопределено и 211 ppb [58]. В този контекст, за да имитираме условията на полето, ние проучихме ефектите на тези микотоксини заедно и за да оценим ефективността на сместа от странични продукти за противодействие на ефектите на микотоксините. Естествените добавки (гроздови семена и вторични продукти от морски зърнастец) са избрани въз основа на тяхната способност да облекчават микотоксикозата при диетични добавки [59,60].
В настоящото проучване излагането на прасенца (Е2 група) на смес от микотоксини не повлиява представянето на животните (27,83 ± 1,1 срещу 27.09 ± 1,3 за телесно тегло и 1,48 ± 0 .9 срещу 1,40 ± 0.8 за прием на храна) и биохимични параметри в сравнение с контролата. По подобен начин, Balogh et al. [61] съобщават, че прасенцата, хранени с приблизително 0,4 mg/kg OTA по време на стартовия (0–28 дни) и периода на отглеждане (29–49 дни), не регистрират значителни промени в производствените характеристики и клиничните признаци на токсичност при отглеждането фаза. Обратно, значително намаляване на наддаването на телесно тегло се наблюдава по време на началния период, когато животните са по-чувствителни. В това проучване включването в диетата само на сместа от странични продукти има значително влияние върху производителността на животните (група E1) и има тенденция да увеличава теглото на прасенцата, когато сместа е свързана със замърсена храна (група E3).
От токсикологична гледна точка OTA е класифициран от IARC (Международна агенция за изследване на рака) в същата група (2B) канцерогенни вещества за хората, имащи подобна токсичност с AFB1 [62]. Токсикокинетичните модели на абсорбция, разпределение и елиминиране на тези микотоксини в по-голямата си част са напълно изяснени. Обратно, въпреки скорошния напредък, нашите познания за стъпките на токсикокинетичната биотрансформация не са изяснени в детайли. Редица проучвания показват, че AFB1 и OTA се метаболизират от чернодробни микрозоми от хора, прасета и плъхове в няколко епимера [63]. Промените в специфичната активност и индуцируемостта на цитохроми P450 в крайна сметка определят относителната промяна в метаболизма на всеки ксенобиотик.
Установено е, че експозицията на AFB1 и OTA намалява генната експресия на гените CYP1A2, CYP2E1, CYP3A29 и MRP2 в черния дроб на прасето и води до няколко промени в чернодробната хистология и ултраструктура, включително фокални области на некроза, дилатация на синусоида, възпалителен паренхим инфилтрация и перипортална фиброза. По отношение на нивото на генна експресия на CYP450 изоформи при прасетабъбрек,няма налични данни в научната литература. Гените CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 и GSTA1 бяха избрани за това изследване, тъй като те кодират протеини с ензимна активност или транспортна функция, които участват във фаза I и фаза II на биотрансформация и детоксикация на ксенобиотици за образуване на електрофилни реактивни метаболити [64]. Според тези резултати изглежда, че прилагането на страничен продукт е определило намаляване на експресията на ген CYP1A2 и увеличаване на експресията на ген GSTA1. Подобни резултати са забелязани при HT-29 човешки ракови клетки на дебелото черво, третирани с екстракт от Salicornia freitagii, известен със своята антиоксидантна и противовъзпалителна активност. В този случай, поради съдържанието му в биоактивни феноли, се наблюдава понижена регулация на CYP1A2 иРНК и повишена регулация на GSTA1 иРНК [65]. За разлика от нашите резултати, тРНК и протеиновата експресия на CYP1A2 са повишени в черния дроб на прасета, хранени с цикория [66]. Тези различни резултати вероятно са причинени от различните естествени съединения, присъстващи в цикорията в сравнение със страничните продукти, използвани в настоящото изследване, главно хлорогенова, кафеена и р-кумарова киселина [67].
От друга страна, OTA и AFB1 вероятно взаимодействат и активират ароматния въглеводороден рецептор, което води до неговото ядрено преместване. След хетеродимеризацията OTA и AFB1 вероятно са взаимодействали с въглеводороден рецепторен ядрен транслокатор, хетеродимерът, свързан с реагиращи на ксенобиотици елементи и трансактивирани гени като CYP1A1, CYP1A2 и GST [68]. Този реагиращ на ксенобиотици елемент се споделя между гените CYP1A1 и CYP1A2 [69] и двата ензима, кодирани от тях, представят припокриваща се субстратна специфичност [70]. В свинския черен дроб присъства само активност на CYP1A2 и относителното му количество от общия открит CYP450 е 4 процента [71]. В човешкия черен дроб AFB1 и OTA са индуктори за CYP1A1, 1A2, 2B6, 2C9, 3A4 и 3A5 [72]. AFB1, както и експозицията на OTA, генерират митохондриална дисфункция, характеризираща се с увеличаване на производството на ROS [14], което може да увеличи експресията на TGF- 1 или да активира латентен TGF- 1 [73]. Като се вземат предвид предишните доказателства, че TGF- 1 намалява експресията на CYP1 при хора и плъхове, е възможно същият механизъм [74] да е възникнал при нашите условия. Ефектите от съпътстващата експозиция както на микотоксини, така и на странични продукти от гроздови семена и морски зърнастец вероятно са синергични и експресията на CYP1A2 е по-ниска в E3 в сравнение с E1, E2 и контролната група. CYP1A2 се експресира в по-ниски нива в екстрахепаталните тъкани [75].
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ
Theбъбреке орган, който получава около 25 процента от сърдечната мощност и пречиства метаболитните остатъци и ксенобиотиците от кръвоносната система. По време на този процес на изхвърляне токсичните вещества се концентрират вбъбрек[76]. В прасенцебъбрецивариацията на генната експресия на CYP1A2 е сходна с нивата на експресия в черния дроб за Е1 и Е2. Интересното е, че в групата E3 експресията на този ген е на по-високо ниво от контролната група. Това вероятно може да се дължи на активирането на неканоничен сигнален път за AhR транскрипция вбъбрекклетки [77]. В черния дроб на прасета относителните количества на CYP2A19 и CYP2E1 представляват 31 процента, съответно 13 процента от общия CYP450 [71]. Свинските гени CYP2A19 и CYP2E1 са отговорни за биотрансформацията на ендогенни съединения (скатол, полови хормони), както и екзогенни съединения (хранителни компоненти). И двата вида съединения са силно експресирани в черния дроб и по-малко вбъбреки мастна тъкан. Транскрипцията на CYP2A19 се контролира от транскрипционния фактор CAR [78]. Неговият човешки ортолог, CYP2A6, се контролира от CAR, PXR, глюкокортикоиден рецептор (GR), естрогенен рецептор, HNF4 и PGC-1 [79]. Също така, конститутивната чернодробна експресия на CYP2A6 при мишки се управлява от взаимодействие между HNF 4, CCAAT-box/енхансер свързващ протеин (C/EBP, C/EBP) и октамерен транскрипционен фактор-1 (Oct{{13} }) [ 80 ]. Преди това беше наблюдавана положителна корелация между нивата на иРНК и протеин за CYP2A19 ген [81]. За разлика от други гени на CYP 450, CYP2A19 играе по-малко важна роля в метаболизма на ксенобиотиците, но участва в реакцията на клетките към стрес, Nrf-2, като участва и в транскрипцията на CYP2A19 [82]. Генът CYP2A19 вероятно е силно полиморфен в сравнение с гена CYP2A6 [83] и може да възникне широка междуиндивидуална вариация на неговия продукт. Предишни проучвания разкриха, че патица P450 ортолози на CYP2A6 и CYP3A4 на бозайници участват в биоактивирането на AFB1 в неговата епоксидна форма [84]. За разлика от тези резултати, в настоящото изследване не са забелязани значителни промени в експресията на ген CYP2A19 в групите E1 и E2, вероятно поради високото ниво на експресия на този ген в черния дроб на прасенца. Засега е трудно да се обясни защо съвместната експозиция както на микотоксините, така и на сместа от гроздови семена и брашно от морски зърнастец намалява експресията на CYP2A19. Въпреки това, това намаляване на експресията намалява риска от генериране на токсични метаболити.
В прасебъбрек,експресията на CYP2A19 е по-ниска в сравнение с тази, открита в черния дроб [79]. Вероятно поради тази по-ниска експресия, излагането на животни на смес от гроздови семки и брашно от морски зърнастец генерира повишена регулация на индуцираната от Nrf-2 генна експресия на CYP2A19 поради съдържанието на лутеолин [85] и ферулинова киселина [86] . От друга страна, има доказателства, че само два транскрипционни фактора, т.е. транскрипционният фактор на промотора нагоре по веригата на пилешки овалбумин (COUP-TF1) и хепатоцитен ядрен фактор (HNF-1), участват в регулирането на транскрипцията на CYP2E1 при прасета [87]. CYP2E1, подобно на други P450s, метаболизиращи ксенобиотици, се намира главно в мембраната на ендоплазмения ретикулум (ER) и може да бъде индуциран при различни метаболитни или хранителни условия. ER стресът може да бъде предизвикан от метаболитен стрес, който се причинява от претоварване на биосинтезата на протеини/липиди, и оксидативен стрес, който може да задейства еволюционно запазения сложен хомеостатичен сигнален път, известен като разгънат протеинов отговор (UPR) [88].
Вероятно нивото на CYP2E1 иРНК е приблизително еднакво в E1 и контролните групи поради антагонистичните действия на палмитинова киселина [89], линолова и линоленова киселина [90], които увеличават тази генна транскрипция и действията на ванилия и р-кумаринови киселини, които го намаляват [65]. Наскоро беше доказано, че фуражи, съдържащи OTA, променят чревната микробиота при патици, засягайки разнообразието и състава на микробиотата на цекума, както и чревната бариера. В резултат на това грам-отрицателните бактериални липополизахариди навлязоха в кръвта и черния дроб, причинявайки възпаление на черния дроб [91]. В случай на имуномедиирано чернодробно увреждане, експресията на CYP2E1 е намалена [92]. Тази ситуация може да възникне в група E2. Вероятно кумулативните ефекти на двата микотоксина и диетичните странични продукти са намалили експресията на CYP2E1 в черния дроб на Е3 групата. Вбъбрек,свободни мастни киселини, като палмитат, олеат и линолеат, се съхраняват в нефрона [93] и тези киселини вероятно повишават експресията на гена CYP2E1 вбъбрециот група Е1 в сравнение с контролното ниво. Според Pfohl-Leszkowicz и Manderville [25], OTA образува адукт с ДНК, генерирайкибъбречнагенотоксичност и канцерогенеза. Вероятно високите нива на OTA стимулират генната експресия на CYP2E1 вбъбрециот групата E2 в сравнение с контролното ниво. В групата E3 изглежда, че едновременното приложение на двата микотоксина и диетични странични продукти има антагонистични ефекти, като експресията на гена CYP2E1 се връща към контролното ниво. Освен това, хистологичната оценка за групата E3 показа, че сместа от странични продукти, получена от масло от гроздови семки и морски зърнастец, смекчава вредните увреждания, причинени от афлатоксин В1 и охратоксин А в черния дроб ибъбречнаниво при прасенца след отбиване. CYP2E1, подобно на други P450s, метаболизиращи ксенобиотици, се намира главно в мембраната на ER и може да бъде индуциран при различни метаболитни или хранителни условия [89]. Регулирането на гена CYP2E1 в групата Е1 вероятно се дължи на хидроксилирането на съединения, получени от кумарин, които са катализирани от ензими CYP2A, които се считат за специфични индикатори за наличието на ензими CYP2 [94], с р-кумарин киселина, присъстваща в страничните продукти от гроздови семена и морски зърнастец.
В случай на прасета се знае много малко за наличието на ензими CYP3As вбъбречна тъкан,и нищо не се знае за тяхната индуцируемост [95]. Няколко гена са идентифицирани в подсемейството CYP3A на бозайници (например пет при плъхове и четири при хора), но експресията на тези гени вбъбречни тъкание слабо проучен [96]. По отношение на генната експресия, Ayed-Boussema et al. (2012) [63] и Gonzalez-Arias et al. [97] описва повишаване на нивата на експресия във всички анализирани цитохроми (CYP3A4, 2B6, 3A5 и 2C9) в първична култура на човешки хепатоцити. Предишни проучвания съобщават за различни резултати по отношение на ефектите на AFB1 и OTA в първично култивирани човешки хепатоцити, в които нарастващите концентрации на тези микотоксини ясно индуцират нива на CYP3A4 и CYP2B6 иРНК по дозозависим начин [63]. Обратно, установено е, че в присъствието на OTA и AFB1 в черния дроб (Фигура 3, група E2), нивата на експресия на CYP3A29 се понижават в сравнение с контролните нива, вероятно поради активиране на AhR [98]. Тези данни се различават от тези на Zepnik et al. [99], който съобщава за повишаване на хидролизата на OTA от микрозомални ензими от черен дроб на плъх, специално за P450 3A1/2 и 3A4, което предполага, че тази генна експресия е модулирана по начин, зависим от вида. В някои случаи инхибирането на ензими P450 от полифеноли може да има химиопрофилактичен ефект поради потенциалното активиране на канцерогени от ензими P450 в хода на тяхната естествена метаболитна активност. Инхибирането на метаболизиращите ксенобиотиците фаза I ензими може да бъде една от целите на химиопревантивните ефекти на естествено срещащите се пръстенни полифеноли. Увеличаването на CYP4A24, наблюдавано в черния дроб, може да бъде физиологичен отговор в необичайния контекст на анормално натрупване на липиди и липса на активност на CYP2E1, поради факта, че CYP2E1 и CYP4A са индуцируеми чернодробни микрозомални цитохроми P-450, участващи в хидроксилирането на мастни киселини, и двете могат да инициират автопропагативния процес на липидна пероксидация. Те могат да се допълват, което води до взаимодействия в регулацията на отделните ензими [100]. Следователно е ясно, че CYP4A протеините са ключови посредници в адаптивния отговор към смущението на чернодробния липиден метаболизъм [101]. Намаленото ниво на CYP4A24 вбъбреквероятно води до токсичните ефекти, генерирани в черния дроб поради заразената с микотоксини диета, което означава, че CYP4A24 регулира чернодробния ER стрес [102,103].
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
В настоящото проучване добавянето на смес от странични продукти от брашно от гроздови семена и морски зърнастец повишава нивата на експресия вбъбрек,което се очаква да благоприятства процесите на елиминиране и поддържане на баланса на вътреклетъчните вещества [104]. Освен това, OTA се абсорбира в червата, където протеинът 2 на множествена лекарствена резистентност (MRP2 ген) играе важна роля, действайки като ксенобиотичен транспортер навън, за да намали оралната бионаличност и натоварването с токсини в органите и, следователно, токсичността на OTA. След като OTA достигне кръвния поток, той може да достигне до други органи като черния дроб и MRP2 транспортерът отново е ключов първичен активен транспортер, участващ в екструзията на анионен конюгат и ксенобиотик в извънклетъчното пространство, което допринася за образуването на жлъчка и последващото елиминиране на токсина [ 97, 105]. Също така, MRP2 транспортерът присъства в апикалните мембрани на ентероцитите,бъбрек-проксимални тубули и други клетки [105]. Токсичността на ОТА се приписва на неговата изокумаринова част и е добре известно, че ОТА се инактивира или биоактивира от ензимите на цитохром Р450 [29]. Преди това наличието на ОТА във фуражите беше свързано с развитието на нефротоксичност, която при плъхове се свързваше сбъбречнааденоми ибъбректумори [97]. В настоящото изследване беше установено намаляване на експресията на MRP2 в черния дроб, което показва увреждане на секрецията на микотоксини в Е2 групата.
При плъхове се наблюдава, че OTA се екскретира с 15 процента по-малко в проксималните тубули набъбрек,докато проксималният тубуларен транспорт на аминокиселини не е нарушен [97, 106]. Следователно, намаляването на MRP2 в черния дроб, установено в това проучване, може да бъде механизмът, чрез който микотоксините достигат високи проценти на бионаличност in vivo. По този начин експозицията на AFB1 и OTA на прасенца ще бъде увеличена, което ще допринесе за хепатотоксичността. Като се има предвид нефротоксичният потенциал на OTA и AFB1, намаляването на MRP2 генния продукт може също да има голямо въздействие върху проксималните тубули, което води до намален капацитет за елиминиране на OTA [97]. Необходими са обаче допълнителни проучвания върху транспортния механизъм AFB1 и OTA, за да се подкрепи тази хипотеза. Във фаза II на метаболитна детоксикация, оригиналното ксенобиотично съединение или междинните метаболити, модифицирани по време на фаза I, се конюгират, за да бъдат подходящи за екскреция. Глутатион S трансферазите (GST) и UDP гликурозилтрансферазите (UGT) допринасят за обработката във фаза II [107].
В присъствието на смес от странични продукти от брашно от гроздови семена и морски зърнастец в храната на прасетата, нивото на експресия на GSTA1 в черния дроб е значително повишено, вероятно от реагиращ на антиоксидант елемент (ARE) и -NF-чувствителен елемент (-NF-RE), съответно, които в присъствието на фенолни антиоксиданти активират GST изоформите без необходимост от арил въглеводородни (Ah) рецептори [108]. Изненадващо, в изследването на Ghadiri et al. (2019) [ 109 ], AFB1-медиираната иРНК регулация на GSTA1 е наблюдавана в черния дроб на крава в присъствието на антиоксидант. Предишни проучвания [110] показаха, че OTA и AFB1 се конкурират за едни и същи ензими CYP450, които представляват пътя на биоактивиране на AFB1, като се произвеждат по-малко AFB1-ДНК адукти. Поради тази конкуренция, AFB1 вероятно може да бъде конюгиран с редуциран глутатион в реакция, катализирана от GST ензими, като техните кодиращи гени се регулират нагоре. AFB1 може да бъде включен в други типове реакции от фаза II, т.е. глюкурониране и сулфатиране, докато OTA е главно конюгиран с редуциран глутатион [72]. Освен това, в отговор на едновременното приложение при прасетата, храната с два микотоксина (AFB1 и OTA) повишава генерирането на биомаркери за оксидативен стрес. Следователно, защитните механизми са активирани, насърчавайки адаптацията и оцеляването в отговор на оксидативния стрес [111]. Например, ROS и оксидантите могат да активират транскрипцията на GST изоформите чрез ARE [108], както се наблюдава както в черния дроб, така ибъбрецичрез повишаване на нивото на експресия на гена GSTA1.
Изводи
Нашите данни разкриха наличието на разлики между прасенцатабъбреки черен дроб по отношение на реакцията срещу микотоксини и странични продукти, използвани в това изследване. Като цяло, страничните продукти с антиоксидантно действие намаляват експресията на анализираните CYPs иРНК в черния дроб и ги повишават вбъбрек. Също така, и в двата органа съвместното излагане на прасенца на OTA и AFB1 генерира увеличение или намаляване на генната експресия в зависимост от генния тип. Включването на брашно от гроздови семена и морски зърнастец в диетата на прасета, интоксикирани с OTA и AFB1-, намалява генната експресия на CYP P450, което предполага намаляване на биоактивирането на тези микотоксини, което вероятно води до намалена токсичност и в двата органа, тъй като разкриха хистологични изследвания. Тези открития предполагат, че отпадъците от брашно от гроздови семена и морски зърнастец представляват обещаващ източник за противодействие на вредния ефект на охратоксин А и афлатоксин В1. Въпреки че е необходима допълнителна работа, за да се разкрият механизмите, чрез които страничните продукти от гроздови семки и морски зърнастец влияят върху биотрансформацията на AFB1 и OTA и следователно върху генерирането на токсични метаболити, защитните ефекти изглежда са поне частично медиирани от повишаването на антиоксидантната защита в черния дроб ибъбрекниво.
Материали и методи
Експериментален дизайн и събиране на пробиЧетиридесет кръстосани прасенца TOPIGS-40 хибрид (♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, основно Duroc) след отбиване със средно телесно тегло 9,11 ± 0.{{16 }}3 kg бяха разпределени в три експериментални групи (E1, E2, E3) и една контролна група (C), настанени в кошари (две повторения от пет прасета на кошара на лечение) и хранени с експериментални диети за 3{{19} } дни. По време на експеримента се предлагат ad libitum храна и вода. Основната диета се използва като контрола и съдържа нормален комбиниран фураж за стартерни прасенца без микотоксин (царевица 68,46 процента, соево брашно 19 процента, царевичен глутен 4 процента, млечен заместител 5 процента, L-лизин 0.3 процента, DL-метионин 0.1 процента, варовик 1,57 процента, монокалциев фосфат 0.35 процента, сол 0,1 процента, холин премикси 0,1 процента и 1 процент витаминно-минерални премикси). Експерименталните групи бяха хранени, както следва: E1 — основна диета плюс смес (1:1) от два странични продукта (гроздови семена и брашно от морски зърнастец) в процентно съотношение 5 процента чрез заместване на брашно от царевица и соя; E2—основната диета, изкуствено замърсена с микотоксини (смес от 62 ppb афлатоксин B1- AFB1 и 479 ppb охратоксин A-OTA); и E3—основна диета, съдържаща 5 процента от сместа (1:1) от брашно от гроздови семки и морски зърнастец и замърсена със смес от AFB1 и OTA. Сместа от микотоксини OTA и AFB1 беше любезно предоставена от д-р Boudra и д-р Morgavi от INR A, център на Клермон Феран, и беше произведена чрез култивиране на Aspergillus flavus и Aspergillus ochraceous върху пшеница, както вече е описано от Boudra et al. [ 112 ]. Полученият замърсен материал беше включен в диетите за групите E2 и E3, което доведе до крайна концентрация от 479 ppb OTA и 62 ppb AFB1. Животните от всички експериментални групи имаха свободен достъп до храна и вода за лечение всеки ден от експерименталния период (30 дни). Брашното от гроздови семки и брашното от морски зърнастец бяха предоставени от две местни реклами, SC OLEOMET-SRL и BIOCATINA, Букурещ, Румъния. След 4 седмици животните бяха заклани с одобрението на Комитета по етика на Националния научноизследователски институт за хранене и биология на животните, Balote s, ti, Румъния (Комитет по етика № 118/02.12.2019) и в съответствие с Румънски закон 206/2004 и Директива 98/58/EC на Съвета на ЕС за обработка и защита на животни, използвани за експериментални цели. В края на експерименталния период на това изследване бяха измерени продуктивните параметри, теглото и консумацията на фураж. Черен дроб ибъбрекпроби бяха събрани от четири животни на група и перфузирани с ледено студен физиологичен разтвор за отстраняване на кръвта. Фрагменти от ~50 mg от десния чернодробен лоб ибъбречнакортекс (три от всеки) бяха събрани в RNAlater Stabilization Reagent (Qiagen, Germantown, Maryland) и след това съхранени при -80 ◦ C до етапа на изолиране на РНК. Поради етични причини, максимално използване на всяко животно, минимизиране на загубата на животни и статистически анализ, броят на индивидите беше намален, доколкото е възможно от научна гледна точка. Добрата наука и добрият експериментален план помагат да се намали броят на животните, използвани във всяко изследователско изследване, което позволява на учените да събират данни, използвайки минималния брой необходими животни [113].
Характеристика на фуражаФуражните диети бяха анализирани за основен химичен състав (сухо вещество, суров протеин, сурови мазнини, сурови влакнини и пепел) съгласно методите на Международната стандартна организация (SR ISO 6496/2001, Стандартизиран бюлетин (2010). http://www. asro.ro (достъп на 13 февруари 2021 г.)). Биоактивните съединения от странични продукти, като полифеноли, полиненаситени мастни киселини (PUFA) и минерали, се определят чрез реакция на Folin-Ciocalteu, HPLC-UV-Vis и газова хроматография, както е описано от авторите на [113, 114]. Антиоксидантната активност се определя по метода DPPH, както е описано по-рано от авторите на [115].
Анализ на плазмени биомаркериНа 30-ия ден асептично бяха взети кръвни проби от гладни прасенца. Маркерите, които отразяват функционалността на черния дроб (аспартат трансаминаза-AST, аланин трансаминаза-ALT, гама глутамил трансфераза-GGT, общ протеин, алкална фосфатаза-AKL) и бъбреците (албумин, креатинин) се определят след центрофугиране на кръв с помощта на настолен апарат за клинична химия анализатор Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Ървайн, Калифорния, САЩ).
Изследване със светлинен микроскопЧерен дроб ибъбрекбиопсиите бяха фиксирани в 4 процента буфериран с фосфат разтвор на формалдехид, дехидратирани, избистрени и включени в парафинови блокове. Срезовете от 5 µm се обработват рутинно за оцветяване с хематоксилин-еозин и трихром на Gomori (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Германия), съответно, съгласно протокола на Leica. Микроскопските срезове бяха анализирани с микроскоп Olympus BX43, оборудван с цифрова камера Olympus XC30. Хистопатологичните промени в черния дроб ибъбрекбяха класифицирани по тежестта на лезиите като принадлежащи към степени 1-4, както е описано по-рано [116]. За черен дроб, степен 1: нормален аспект; степен 2: Нормални хепатоцити, леко разширени синусоиди и конгестия; степен 3: Вакуолизирани хепатоцити, разширени синусоиди и конгестия; умерена пролиферация на колаген; степен 4: Некроза, възпалителни инфилтрати, пролиферация на колаген. За бъбрек, степен 1: нормален аспект; степен 2: леки тубулни/гломерулни наранявания, възпаление и пролиферация на колаген; степен 3: Леки тубулни/гломерулни наранявания, възпаление и пролиферация на колаген; степен 4: изразени тубулни/гломерулни наранявания, възпаление и пролиферация на колаген. "Средна оценъчна стойност" (MAV) беше изчислена като средна стойност на всички данни за експериментална група.
Изолиране на РНКИзолирането на обща РНК се извършва от 10 mg тъкан, като се използва RNeasy Plus Universal Mini Kit (Qiagen), следвайки протокола на производителя. Освен това, той включва стъпката на разграждане на ДНКазата в колона. След изолирането на РНК бяха направени аликвотни части, за да се предотврати разграждането, предизвикано от циклите на замразяване-размразяване. Концентрацията и чистотата на общата РНК се определят с помощта на спектрофотометър NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Номер на целостта на РНК (RIN)Стойностите на RIN на РНК пробите бяха определени с помощта на Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ) и Agilent 2100 Bioanalyzer, използвайки протокола на производителя. Проби с RIN стойности по-малки от 8 не бяха включени в по-нататъшен анализ и стъпките на изолиране бяха повторени.
Обратна транскрипцияЗа синтез на cDNA, 1000 ng от общата РНК се подлага на обратна транскрипция, използвайки iScript комплект за синтез на cDNA (Bio-Rad, Hercules, СА, САЩ). Реакционна смес от 4 µL и 1 µL обратна транскриптаза се смесват с 1 µL РНК проби и се допълват с вода без РНКаза до общ обем от 20 µL. Крайната концентрация на РНК е 1000 ng за реакция. Реакцията беше извършена с помощта на термоциклер Veriti 96-Well (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ) със следната програма: Един цикъл от 25°C за 5 минути, един цикъл от 42°C за 30 минути и един цикъл от 85 ◦ C за 5 min. Концентрацията и чистотата на сДНК пробите се определят с помощта на спектрофотометър NanoDrop 8000 (Thermo Scientific).
Грунд дизайнПоради липсата на данни относно гените, участващи в хепато-нефротоксичността при експозицията на микотоксини на отбити прасета, праймерните последователности (Таблица 7) са проектирани in silico с помощта на Primer3Plus [59] и проверени от програмата BLAST [117]. Тези с най-висока специфичност за целевата последователност бяха избрани, за да се увеличат гените CYP1A2, CYP2A19, CYP2E1, CYP3A29, CYP4A24, MRP2 и GSTA1 и три референтни гена, кодиращи TATA-box свързващ протеин, рибозомален протеин L4 и бета{ {19}}микроглобулин в Sus scrofa. Температурите на отгряване на праймерите се определят чрез PCR с температурен градиент.
PCR в реално времеPCR реакцията в реално време се провежда на iCycler iQ PCR система за откриване в реално време (Bio-Rad), като се използва iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad). В 96-ямкова плака, 1 µL от 1{{10}}0 ng/ µL кДНК, 12,5 µL iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad), 0,5 µL от 20 pmol/µL прав праймер, 0.5 µL от 20 pmol/µL обратен праймер и 10.5 µL MilliQ вода бяха добавени. Общият обем е 25 µL. Програмата за усилване се състои от 1 цикъл от 95 ◦ C за 5 минути, 45 цикъла от 95 ◦ C за 30 s, 55/56 ◦ C за 30 s, 72 ◦ C за 45 s и 85 цикъла от 55 ◦ C, с повишаване на зададената температура с 0,5 ◦ C на цикъл за 10 s. Пробите бяха пуснати и стойностите на праговите цикли (Ct) бяха записани. Бяха направени и криви на топене.
Анализ на данниСтойностите на Ct бяха обработени, както е посочено в „Указанията на MIQE: Минимална информация за публикуване на количествени PCR експерименти в реално време“ [ 118 ] с помощта на OpenOffice Calc съгласно метода 2- ∆∆ Ct, описан от Livak и Schmittgen (2001 ) [ 119 ]. Референтните гени (TBP, RPL4 и B2M) бяха избрани, за да бъдат стабилно експресирани в различни типове тъкани и лечения върху проби от свине [120, 121]. Относителната стойност на експресия (2 − ∆∆Ct ) беше получена чрез нормализиране, изваждане на средната аритметична стойност на референтните гени от всеки интересен ген. Техническите реплики бяха осреднени преди статистическия анализ. Данните са илюстрирани като средни стойности на групите (n=4) ± отклонение на стандартната грешка на средната стойност (STDEV). Всички данни бяха статистически анализирани с помощта на еднопосочен ANOVA метод, извършен със софтуер GraphPad Prism 3.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Последващите сравнения между всички групи бяха проведени с помощта на теста на Bonferroni. Статистическата значимост (p стойност) е представена за всички групи за разлика от контролната група (C).