Бързото и спонтанно следродилно изчистване на Plasmodium Falciparum е свързано с експулсията на плацентата

Паразитемията сред бременни жени със защитен имунитет към маларията на Plasmodium falciparum често е доминирана от VAR2CSA-положителни инфектирани еритроцити (IE). VAR2CSA медиира секвестирането на IE в плацентата. Ние предположихме, че наблюдаваното преди това спонтанно следродилно изчистване на паразитемия при такива жени е свързано с експулсирането на плацентата, което премахва секвестрационния фокус на VAR2CSA-позитивните IE. Ние оценихме паразитемията и генната транскрипция преди и малко след раждането при 17 жени от Гана. Стремителният спад на паразитемията след раждането беше придружен от селективно намаляване на транскрипцията на гена, кодиращ VAR2CSA. Нашите открития предоставят механистично обяснение за по-ранното наблюдение.

Ключови думи.

придобит имунитет; VAR2CSA; pfEMP1; плацентарна малария; Plasmodium falciparum; бременност; var гени; специфичен за варианта имунитет.

Жителите на райони със стабилно предаване на паразити Plasmodium falciparum придобиват значителен защитен имунитет срещу малария в детството, прегледано в справка [1]. P. falciparum еритроцитен мембранен протеин 1 (PfEMP1) е семейство от паразитни антигени, кодирани от приблизително 60 var гена на геном и медииращи секвестрацията на зрели инфектирани еритроцити (IE) за приемане на васкуларни рецептори, разгледани в справка [2]. Въпреки важността на PfEMP1 в придобития защитен имунитет, жените в такива области все пак стават силно податливи на малария по време на бременност. Това е свързано с инфекции с паразити, експресиращи VAR2CSA-тип PfEMP1, което води до натрупване на IE в интервилозното пространство, причинявайки плацентарна малария [2, 3].

VAR2CSA медиира адхезията на IEs към ниско сулфатиран хондроитин сулфат (CSA), приемен рецептор, който обикновено е ограничен до плацентата [4]. Рецепторно-специфичното секвестиране на IE е важна стратегия за оцеляване на паразита, тъй като предотвратява разрушаването на далака на зрели IE [2]. Следователно VAR2CSA-позитивните IE са в огромно неблагоприятно положение за оцеляване при небременни гостоприемници и VAR2CSA-специфичният имуноглобулин G (IgG) не се придобива преди първата бременност [2, 3]. Това обяснява високата чувствителност на бременните жени (и по-специално на примигравидите) към P. falciparum малария, дори в райони със стабилно предаване на паразити, където значителен защитен имунитет се придобива доста преди достигане на детеродна възраст [3]. Инфекциите с P. falciparum при бременни жени наистина често са доминирани от паразити, експресиращи VAR2CSA [5], въпреки че често се срещат и паразити, експресиращи други видове PfEMP1 (и предполагаемо секвестиране извън плацентата) [6]. На тази основа предлагаме да се дефинират 2 фундаментално различни вида малария при бременни жени. Едната е плацентарна малария, която се причинява от паразити, експресиращи VAR2CSA и която се среща главно при жени с нисък паритет без значителен VAR2CSA-специфичен защитен имунитет. Другият тип е малария, причинена от паразити, които експресират други типове PfEMP1 и където IE се изолират в неплацентарни тъкани. Последният тип не е ограничен до бременни жени и може да се появи при жени от всякакъв тип. Той просто отразява пропуски във вариант (главно PfEMP1)-специфичен имунитет като цяло [7].

Имайки предвид тези точки, ние предположихме, че по-ранни доклади за спонтанно разрешаване на P. falciparum паразитемия при бременни жени в Африка в рамките на няколко дни след раждането [8, 9] отразяват внезапното изчезване на секвестрационния фокус на VAR2CSA-позитивните IE като плацентата се изхвърля по време на раждане.

МЕТОДИ

Място за изследване и участници

Проучването е проведено в 5 здравни заведения (Abura Dunkwa, Biriwa, Mankessim, Moree и Saltpond) в централния регион на Гана. Предаването на P. falciparum в изследваната зона е стабилно, но със значителни сезонни вариации.

Бременни жени на кратък срок, които са се съгласили писмено да участват в проучването, след като са получили устна и писмена информация за целите му, са били наети между ноември 2020 г. и февруари 2021 г. Жените с каквато и да е форма на усложнения на бременността са били изключени от участие. Въпреки че повечето от жените са получавали интермитентно превантивно лечение като част от текущата политика за пренатална грижа в Гана (допълнителна таблица 1), нито една от тях не е получавала каквато и да е форма на антималарийно лечение за продължителността на проучването (т.е. от малко преди раждането до края на тяхното участие няколко дни по-късно). Проучването е одобрено от институционалния съвет за преглед към Мемориалния институт за медицински изследвания Ногучи (NMIMR-IRB CPN 005/20-21) и от комитета по етика на изследванията на Здравната служба на Гана (GHS-ERC 005/08/20).

Откриване и количествено определяне на инфекция с P. falciparum

Инфекцията от P. falciparum паразити се определя чрез бърз диагностичен тест, чрез микроскопия на оцветени с Giemsa кръвни натривки и чрез количествена полимеразна верижна реакция (qPCR) по същество, както е описано по-горе [10, 11], като се използват събраните проби от периферна кръв. ДНК, извлечена от шест 10-кратни разреждания на in vitro култура на P. falciparum IT4 в пръстенов стадий при 1 процент паразитемия, беше използвана за установяване на стандартна крива, за да позволи qPCR количествено определяне на паразитемия.

Анализ на var генна транскрипция

Parasite RNA was preserved in the field and used for quantification of var gene transcript levels essentially as described [11, 12], but using universal 1-step reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) kits (E3005X, NEB Inc), a Quant Studio 5 thermal cycler system and fructose-bisphosphate aldolase as endogenous control. Data points were not considered if the cycle threshold (Ct) value for the endogenous control was >30 and/or if the Tm for the var gene amplicon for each pair of primers diverged >2 градуса от очакваната стойност. Изобилието на транскрипт се изчислява с помощта на 2-ΔCt, където средно ΔCt=означава Ctvar праймерна двойка − средна Ctendogenous контрола.

Статистически анализ

Асоциациите между транскрипцията на var2csa и клиничните променливи бяха тествани чрез рангова корелация на Spearman с корекция за многократно тестване. Корелацията между паразитемии, открити чрез микроскопия и чрез PCR, беше оценена чрез корелационния тест на Pearson продукт-момент. Данните, получени в различни моменти от време, бяха сравнени чрез анализ на дисперсията с повторени измервания (RM-ANOVA) или чрез RM-ANOVA на ранговете (RM-ANOVA-R), както е подходящо, последвано от post hoc тестване за разлики по двойки. Софтуерът SigmaPlot версия 14 (Systat Inc) беше използван за анализ на данните и P стойностите<.05 were considered significant.

РЕЗУЛТАТИ

Участници в проучването

Общо 377 жени, които са дали съгласие, са били изследвани за инфекция с P. falciparum по време на раждане. От тях 15 (4.0 процента) са били положителни за паразити чрез микроскопия на периферна кръвна натривка от пръст, 24 (6,4 процента) чрез бърз диагностичен тест и 50 (13,3 процента) чрез PCR. Въз основа на тези резултати, 17 жени с положителен тест за бърза диагностика бяха включени и избрани за проследяване на 8-16 часа след раждането, 24-48 часа след раждането и 48-72 часа след раждането. Клиничната информация на участниците в проучването е обобщена в допълнителна таблица 1. Няма статистически значими връзки между дела на var2csa-транскрибиращите паразити и която и да е от изброените клинични променливи.

Следродилно изчистване на паразитемия

По време на раждането всички участници в проучването са били паразитни чрез кръвна натривка и/или qPCR (допълнителна таблица 1). До 8 до 16 часа след раждането, микроскопски откриваемата паразитемия е намаляла спонтанно (т.е. без терапевтична интервенция) при 14/17 жени (Фигура 1А). До 24–48 часа след раждането, паразитемията е намаляла още повече и е била много ниска или неоткриваема при повечето жени (P=.03 в сравнение с предраждането, Friedman RM-ANOVA-R). Още 24 часа по-късно всички жени с изключение на 1 бяха без откриваема паразитемия (P=.005 в сравнение с предраждането, RM-ANOVA-R). По отношение на паразитемиите, открити чрез PCR (Фигура 1B), следродилните паразитемии са значително по-ниски с 24–48 часа и 48–72 часа, отколкото преди раждането (P <.001, RM-ANOVA-R). Нивата също са значително по-ниски до 48–72 часа след раждането, отколкото до 8–16 часа след раждането (P <.001, RM-ANOVA-R). Паразитемиите, оценени чрез микроскопия и qPCR, корелират значително (P <.001). Тези данни потвърждават предишни съобщения за бързо и спонтанно следродилно изчистване на P. falciparum паразитемия сред жени, живеещи в райони със стабилно предаване на този паразит [8, 9].

Паразитна транскрипция на var гени

To identify the likely sequestration focus of the IEs detected, we measured parasite transcription of the PfEMP1-encoding var gene groups. Prior to delivery, var2csa, which encodes VAR2CSA-type PfEMP1 mediating placental IE sequestration [2, 3], was the primary transcript (up to >90 процента от общата var транскрипция) при 9/17 жени и var2csa транскрипцията може да бъде открита във всички (Фигура 2 и допълнителна фигура 1). Транскрипцията на var гени, които не са свързани с плацентарна малария, беше открита (в допълнение към var2csa) във всички участници преди раждането и доминирана при някои жени, в съответствие с предишни наблюдения [6].

Делът на транскриптите на var2csa намалява по време на следродилното проследяване при всички жени (Фигура 2 и Допълнителна фигура 1), успоредно с намаляването на паразитемията (Фигура 1). По този начин имаше подчертано изместване от транскрипция на var2csa преди раждането към транскрипция на други var гени след раждането. Единствените изключения (сред онези жени, при които са налични данни за транскрипция след раждането), са участниците B213, S003, S001 и B201 (допълнителна фигура 1). Въпреки това, въз основа на наблюдението, че следродилните паразитемии също са намалели значително сред тези жени (Фигура 1), ние считаме за вероятно, че щеше да се наблюдава съответно изместване от транскрипцията на var2csa, ако бяха налични данни от по-късни времеви точки. Като цяло, данните са напълно в съответствие със селективното изчезване на VAR2CSA-положителни IE, както предположихме.

ДИСКУСИЯ

PfEMP1 е семейство от протеини, изнесени от интраеритроцитни P. falciparum паразити към повърхността на IE, където те функционират като адхезионни лиганди за различни васкуларни рецептори на гостоприемника [2]. Тези лиганди са кодирани от клонално вариантното var генно семейство с около 60 члена на хаплоиден паразитен геном. Гените се транскрибират и транслират по взаимно изключващ се начин, като се гарантира, че само един PfEMP1 се експресира на повърхността на IE във всеки даден момент. Въпреки това, всеки паразит има потенциала да превключва между различните си var гени, позволявайки промени в специфичността на адхезията на IE и антигенните свойства [2].

Протеините PfEMP1 могат да бъдат групирани и подгрупирани според набор от структурни критерии, които влияят върху техните функционални характеристики [2]. По този начин група А PfEMP1 (кодирана от около дузина var гени на геном) медиира адхезията на IE към приемни рецептори като EPCR и ICAM-1 и е замесена в патогенезата на тежка детска малария като цяло и церебрална малария по-специално [2]. Обратно, транскрипцията на гени, принадлежащи към група B и C, изглежда е свързана с неусложнена малария и асимптоматични инфекции. И накрая, VAR2CSA-тип PfEMP1, кодиран само от един или няколко var2csa гена на паразитен геном, е функционално и антигенно напълно различен от всички други PfEMP1 и е силно замесен в патогенезата на, както и в придобития имунитет към плацентата малария [2, 3, 13].

Освен това, по-голямата част от наличните доказателства сочат VAR2CSA като основен и вероятно единствен добросъвестен CSA лиганд. И накрая, по-рано беше показано, че периферната паразитемия при бременни жени с експозиция на P. falciparum през целия живот включва и често е доминирана от IE, които са VAR2CSA-позитивни и имат общия характерен фенотип на плацентарни инфекции с P. falciparum [5, 13– 15]. Въз основа на това предположихме, че най-убедителното обяснение за спонтанното изчистване на паразитемията при бременни жени в рамките на няколко дни след раждането [8, 9] е селективното унищожаване на далака на VAR2CSA-положителни IE след експулсирането на плацентата по време на раждането, което ефективно премахва техния сроден адхезивен рецептор.

Резултатите, представени тук, потвърждават докладваното по-рано [8, 9] бързо следродилно изчистване на периферната P. falciparum паразитемия (Фигура 1). Освен това те подкрепят наблюденията, че периферната паразитемия при бременни жени в Африка включва и често е доминирана от паразити, транскрибиращи var2- csa [6, 15] (Фигура 2 и Допълнителна фигура 1). Най-важното обаче е, че нашите данни разширяват тези по-ранни наблюдения, като за първи път предоставят убедителни доказателства за механично обяснение за бързото следродилно изчистване на периферните паразити при жени с естествено придобит имунитет към P. falciparum малария. Освен числено много незначителна и само гранично значима разлика в транскрипцията на var група A1 (допълнителна фигура 2), единствената голяма и статистически значима промяна в транскрипцията на var гени след раждането беше намалената относителна транскрипция на var2csa (фигура 2B и допълнителна Фигура 2).

Нашето проучване има ограничения. Размерът на извадката е малък. Това се дължи главно на успешното прилагане на интермитентно превантивно лечение на малария при бременни жени, което направи плацентарната малария много по-малко разпространена и наложи скрининга на много жени, за да се намерят подходящи участници. Освен това, ограничените съоръжения на нашето място за изследване предотвратиха директна оценка на специфичността на адхезионния рецептор на събраните IE или техния имунологичен фенотип. Въпреки това настоящите доказателства и по-ранните открития се съчетават безпроблемно.

В заключение, ние представихме доказателства, че внезапното изчезване на секвестрационния фокус на VAR2CSA-позитивните IE, когато плацентата е експулсирана, допринася значително за бързото и спонтанно следродилно изчистване на P. falciparum паразитемия при жени с естествена експозиция на тези паразити. Паразитите, транскрибиращи други var гени и показващи не-VAR2CSA тип PfEMP1 на повърхността на IE, често не са в състояние да процъфтяват и да причиняват заболяване при възрастни в ендемични райони, поради защитния PfEMP1-специфичен имунитет към малария, придобит в детството [2] . Продължаващото оцеляване на не-VAR2CSA IEs след раждането може да бъде допълнително компрометирано от физиологични процеси, свързани с раждането, като провъзпалителни имунни отговори. И накрая, неразкрит прием на антималарийни лекарства непосредствено преди раждането би могъл да допринесе. Каквато и да е причината, паразитемията е намаляла значително след раждането при някои жени, където var2csaтранскрибиращите паразити представляват само малка част от паразитемията при раждането и това откритие заслужава допълнително проучване. Нашето проучване подкрепя ключовата роля на PfEMP1 в придобития имунитет към малария като цяло и по-специално на VAR2CSA в патогенезата и имунитета на плацентарната малария.

Допълнителни данни

Допълнителни материали са достъпни в The Journal of Infectious Diseases онлайн. Състои се от данни, предоставени от авторите в полза на читателя, публикуваните материали не се копират и са отговорност единствено на авторите, така че въпросите или коментарите трябва да се отправят към съответния автор.

Бележки

Авторски принос.

NGA, MPQ, MFO и LH допринесоха за концепцията и дизайна на проучването. NGA извърши събиране на проби. NGA, MPQ и LH извършиха анализ на данни. NGA, MPQ и LH подготвиха ръкописа. Всички автори прочетоха и одобриха окончателната версия на ръкописа.

Благодарности.

Благодарни сме на всички жени, които се съгласиха да участват в нашето проучване. Благодарим и на всички акушерки, лекари, асистенти и медицински сестри в различните здравни заведения за тяхната помощ при събирането на проби.

Опровержение.

Финансиращите нямат никаква роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Финансирането за заплащане на таксите за публикуване на отворен достъп за тази статия беше предоставено от Danida.

Финансова подкрепа.

Тази работа беше подкрепена от Danida (номер на безвъзмездна помощ 17-02-KU към проекта MAVARECA-II), включително докторантура към NGA. Изпълнителната агенция за изследвания на Европейската комисия подкрепи MPQ (номер на безвъзмездна помощ 101028915, Индивидуална стипендия на Мария Склодовска-Кюри 2020 г. , проект PAMSEQ).

Потенциални конфликти на интереси.

Всички автори: Няма докладвани конфликти на интереси. Всички автори са подали формуляра на ICMJE за разкриване на потенциални конфликти на интереси. Конфликтите, които редакторите смятат за свързани със съдържанието на ръкописа, са разкрити.

Препратки