RNA M6 A Reader YTHDF2 контролира антитуморния и антивирусен имунитет на NK клетките, част 6

Модел на метастатичен меланом и MCMV предизвикателство

B16F10 клетки (105) се инжектират iv в мишки. 14 дни след инжектирането, мишките бяха евтаназирани за постмортален анализ. Метастатичните възли в белия дроб се анализират макроскопски и се преброяват. Клетъчната линия B16F10 е предоставена от Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). Ythdf2ΔNK и Ythdf2WT мишки бяха заразени с ip инжекция на Smith щам MCMV (2.5 × 104 PFU), който беше закупен от American Type Culture Collection (VR-1399). Проби от периферна кръв бяха получени чрез субмандибуларна пункция на дни 0, 4 и 7 след инфекцията.

Нодулите с белодробни метастази се отнасят до възли, образувани от злокачествени туморни клетки от други места, които мигрират към белите дробове чрез кръвта или лимфната система. За много пациенти това е често срещана проява на рак на белия дроб.

Въпреки това, въпреки че белодробните метастази представляват заплаха за физическото здраве на пациентите, няма пряка връзка между това и паметта. Следователно трябва активно да се изправяме пред предизвикателствата на белодробния рак и белодробните метастази и да не позволяваме на отрицателните емоции и безпокойството да повлияят на нашето физическо и психическо здраве.

В същото време можем да поддържаме и подобряваме паметта чрез някои положителни методи. Например, извършете някои тренировки на паметта, като математически изчисления, четене, слушане на музика, игра на игри и т.н. В допълнение, придържането към добри жизнени навици, като редовни упражнения, достатъчно сън, здравословно хранене и т.н. подобряваме паметта си.

Най-важното е да запазите положително отношение. Без значение с какви трудности се сблъсквате, трябва да вярвате в силата си и гъвкавостта на нервната си система и чрез положителни настройки и реакции в крайна сметка успешно ще преодолеете трудностите.

Накратко, въпреки че метастатичните възли в белите дробове представляват заплаха за физическото здраве, те не са пряко свързани с паметта. Трябва да се изправим положително към него и да поддържаме и подобряваме паметта си, като коригираме начина си на живот и поддържаме добро отношение. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche deserticola може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост. Вижда се, че трябва да подобрим паметта и Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola може също да регулира баланса на невротрансмитерите, като например повишаване на нивата на ацетилхолин и растежни фактори. Тези вещества са много важни за паметта и ученето. В допълнение, Cistanche deserticola може също така да подобри притока на кръв и да насърчи доставянето на кислород, което може да гарантира, че мозъкът получава достатъчно хранителни вещества и енергия, като по този начин подобрява мозъчната жизненост и издръжливост.

Щракнете върху познайте добавките за увеличаване на паметта

За да се измери вирусното натоварване в периферната кръв, далака и черния дроб, се изолира ДНК с помощта на QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit за qPCR анализ. Използвани са следните праймери: MCMV-IE1, 59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (напред) и MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (назад).

In vivo лечение на мишка с IL-15

За in vivo лечение на мишка с IL-15, Ythdf2ΔNK и Ythdf2WT мишки бяха инжектирани с 2 µg ip рекомбинантен човешки IL-15 (кат. № 745101; Национален институт по рака) в продължение на 5 дни. След това третираните и контролните мишки бяха евтаназирани за поточен цитометричен анализ.

Поточна цитометрия

Едноклетъчни суспензии бяха приготвени от BM, кръв, далак, черен дроб и бял дроб на Ythdf2ΔNK и Ythdf2WT мишки, както е описано по-рано (Wang et al., 2018b). Анализът на поточната цитометрия и сортирането на клетките бяха извършени съответно на LSRFortessa X-20 и FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences).

Данните бяха анализирани с помощта на софтуер NovoExpress (Agilent Technologies).

Използвани са следните маркирани с флуоресцентно багрило антитела от BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen или Cell Signaling Technology: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70), CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1), KLRG1 (2F1), CD45 ({{46) }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), гранзим B (QA16A02), перфорин (S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), анексин V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) и Eomes (WD1928), фосфо-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), фосфо-Akt (Ser473, #5315), фосфо-S6 рибозомален протеин , фосфо-Stat3 (Tyr705, #9145) и фосфо-Stat5 (Tyr694, #9539).

За оценка на пролиферацията на NK клетки, клетките бяха белязани с 5 цМ CTV (Invitrogen) съгласно протокола на производителя, преди да бъдат прехвърлени в реципиентни мишки. Вътреклетъчното оцветяване на Ki67, Tbet и Eomes се извършва чрез фиксиране и пермеабилизиране с комплекта за оцветяване на Foxp3/транскрипционен фактор (eBioscience).

За откриване на фосфорилирани протеини, пречистените NK клетки на далака бяха предварително третирани с рекомбинантен човешки IL-15 (50 ng/ml) в продължение на 1 час и след това фиксирани с Phosflow Fix Buffer I, последвано от пермеабилизиране с Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) и оцветяване с антитела.

Адоптивен клетъчен трансфер

За оценка на ефекта от дефицита на Ythdf2 върху съзряването на NK клетки, смес от 5 × 106 BM клетки в съотношение 1:1 от CD45.1 или Ythdf2ΔNK CD45.2 мишки бяха котрансферирани в Rag2-/-Il2rg-/-мишки. Възстановяването на реципиентите се оценява чрез поточна цитометрия 8 седмици след трансплантацията.

За експерименти с индуцирана от лимфопения хомеостатична пролиферация, равен брой пречистени далачни NK клетки от CD45.1 или Ythdf2ΔNK CD45.2 мишки бяха котрансферирани в Rag2−/−Il2rg−/− мишки, последвано от оценка на относителните проценти на прехвърлените WT и Ythdf2ΔNK NK клетки в далаците на Rag2−/−Il2rg−/− реципиенти чрез поточна цитометрия в посочени времеви точки.

За метастатичния модел на меланома, 106 IL-2-разширени NK клетки от Ythdf2ΔNK или Ythdf2WT мишки бяха инжектирани iv в Rag2−/−Il2rg−/− мишки. 1 ден по-късно, B16F10 клетки (105) се инжектират iv в мишки. 14 дни след инжектирането, мишките бяха евтаназирани за постмортален анализ. В някои експерименти клетките бяха белязани с CTV (5 µM, Invitrogen), за да се проследи клетъчната пролиферация преди трансфера.

In vivo анализ на трафик

За откриване на трафик на NK клетки от BM към периферна кръв, 1 µg iv APC-маркирано анти-CD45 антитяло се инжектира в C57BL/6 мишки. Две минути след инжектирането на антитялото, мишките бяха евтаназирани незабавно и BM клетките бяха събрани за поточна цитометрия, след като клетките бяха оцветени с CD3 и NK1.1 антитела. Паренхимните NK клетки бяха идентифицирани чрез липса на CD45 оцветяване, докато синусоидалните NK клетки бяха идентифицирани чрез наличието на CD45 маркиране. Следователно, съотношението на NK клетките в синусоидите (CD 45+) към това в паренхимните области (CD45−) показва трафика на NK клетки от BM към периферната кръв в стационарно състояние.

RT-qPCR в реално време и имуноблотинг

РНК се изолира с помощта на RNeasy Mini Kit (QIAGEN) и след това се транскрибира обратно към сДНК с PrimeScript RT Reagent Kit с gDNA Eraser (Takara Bio) съгласно инструкциите на производителя. Нивата на експресия на иРНК бяха анализирани с помощта на SYBRGreen PCR Master Mix и QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR System (и двете от Thermo Fisher Scientific). Праймерните последователности са изброени в Таблица S1.

Имуноблотингът се извършва съгласно стандартните процедури, както е описано по-горе (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Използвани са следните антитела: METTL3 (кат. № 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (кат. №.26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (кат. № 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (кат. № RN123PW; MBL), YTHDF3 (кат. №.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (кат. № ab195377; Abcam),FTO (кат. № ab124892; Abcam), MDM2 (кат. № 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (кат. № PA5-29949; Invitrogen) и -актин (кат. № {{20) }}Ig; Proteintech).

siRNA нокдаун анализ

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90%, измерено чрез поточна цитометрия. Ефективността на генно нокдаун се определя чрез qPCR и имуноблотинг. 3 дни след трансфекцията, клетъчната апоптоза и пролиферацията се анализират чрез поточна цитометрия, както е описано по-горе.

Луциферазен репортерен анализ

Ythdf2 промоторният регион, вариращ от –2, 000 bp до +100 bpof на TSS, беше амплифициран от миши NK клетки и клониран в apGL4-основен луциферазен репортерен вектор (Promega) за генериране на apGL{ {5}}Ythdf2 репортерен плазмид. HEK293T клетки, закупени от ATCC, бяха котрансфектирани с pGL4-Ythdf2 репортерни плазмиди, както и STAT5a или STAT5b свръхекспресионни плазмиди или празен вектор, заедно с pRL-TK Renilla репортерен плазмид (Promega) за нормализиране на ефективността на трансфекцията. Клетките се събират за лизис 24 часа след трансфекцията и луциферазна активност се определя количествено флуориметрично с Dual-Luciferase System (Promega). Праймерни последователности за клониране на Ythdf2 промотера и STAT5a и STAT5b свръхекспресионни плазмиди са изброени в Таблица S1.

Чип анализи

Анализите на ChIP се извършват с помощта на Pierce Magnetic ChIP Kit (кат. № 26157; Thermo Fisher Scientific) съгласно инструкциите на производителя. Накратко, равно количество ананти-анти-фосфо-Stat5 (Tyr694, кат. № 9351; Cell Signaling Technologies) или съответен контролен нормален заешки IgG се използва отделно за утаяване на омрежените ДНК-протеинови комплекси, получени от 5 × 106 пречистени миши първични NK клетки, които бяха предварително третирани с IL-15 (50 ng/ml) в продължение на 1 час. След обръщането на кръстосаното свързване, ДНК, имунопреципитирана от посоченото антитяло, беше тествана чрез qPCR. Последователностите на всички праймери са изброени в Таблица S1.

Ex vivo анализ на цитотоксичност

Ex vivo цитотоксичността на NK клетките се оценява чрез стандартни 51Crrelease анализи. Миши лимфомни клетъчни линии RMA-S (MHC клас Ideficient) и RMA (MHC клас I достатъчен) клетки, подарък от Andre´Veillette (Университет Макгил, Монреал, Канада), бяха използвани като старгетни клетки. Мишките бяха третирани с ip инжекция на полиинозинова:полицитидилова киселина [поли (I: C); 200 ug/мишка] за 18 часа. Поли(I:C)-активираните NK клетки бяха изолирани от далака с помощта на EasySepMouse NK Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies). Пречистените NK клетки се култивират съвместно с клетки-мишени в съотношение 5:1, 2,5:1 и 1,25:1 в присъствието на IL-2 (50 U/ml).

m6A-послед

Пречистените NK клетки на далака се размножават с IL-2 (1,000 U/ml, кат. № Bulk Ro 23-6019; Национален институт по рака) in vitro за 7 d. Общата РНК се изолира чрез TRIzol реагент (Thermo FisherScientific) от 50 милиона IL-2-разширени NK клетки. Полиаденилираната РНК беше допълнително обогатена от общата РНК чрез използване на Dynabeads mRNA Purification Kit (Invitrogen). mRNA пробите бяха фрагментирани на 100-nt-дълги фрагменти с реагенти за фрагментиране на RNA (Invitrogen).

Фрагментирана mRNA (5 µgmRNA) се използва за m6A имунопреципитация, като се използва m6A антитяло (202003; Synaptic), следвайки стандартния протокол на Magna MeRIP m6A Kit (Merck Millipore). РНК беше обогатена чрез RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) за генериране на библиотека с KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Секвенирането беше извършено в съоръжението за геномика на City of Hope на машина Illumina HiSeq 2500 с режим на единично четене 50-bp. Отчитанията на последователността бяха картографирани към мишия геном с помощта на софтуер HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Картирани четения на имунопреципитация и входни библиотеки бяха предоставени с помощта на R пакета exomePeak (Meng et al., 2014). m6Apeaks бяха визуализирани с помощта на софтуера Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). m6A-свързващият мотив беше анализиран от MEME (https://meme-suite.org) и HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). Наречените пикове бяха анотирани чрез пресичане с генна архитектура с помощта на Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2 (промяна на сгъване)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-послед

50 милиона IL-2-разширени NK клетки бяха събрани и промити два пъти със студен PBS и клетъчната пелета беше лизирана с 2 обема лизисен буфер (10 mM Hepes, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM дитиотреитол, 1:100 коктейл от протеазен инхибитор [Thermo Fisher Scientific] и 400 U/ml SUPERase-In RNase инхибитор [Thermo Fisher Scientific]).

Лизатът се инкубира върху лед за 5 минути и се центрофугира за 15 минути, за да се изчисти лизатът. Една десета от обема клетъчен лизат беше запазена като вход. Останалата част от клетъчния лизат се инкубира с 5 µg анти-YTHDF2 (кат. номер RN123PW; MBL), който се свързва с протеин А магнитни перли (кат. № 10001D; Invitrogen) при 4 градуса за 2 часа с леко въртене. След това зърната се промиват пет пъти с 1 ml ледено студен промивен буфер (50 mM HEPES, pH 7,6, 200 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,05% NP-40, 0,5 mM дитиотреитол и 200 U/ml РНКаза инхибитор).

Имунопреципитирани проби бяха подложени на смилане с протеиназа К в промивни буфери, допълнени с 1% SDS и 2 mg/ml протеиназа К (ThermoFisher Scientific), инкубирани с разклащане при 1200 rpm при 55 градуса за 1 час. Общата РНК се екстрахира както от входната, така и от имунопреципитираната РНК чрез добавяне на 5 vol TRIzol реагент, последвано от Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

cDNA библиотеката беше генерирана с KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche) и секвенирана на платформа Illumina HiSeq 2500. Резултатите от пикови повиквания с имунопреципитация и входни библиотеки бяха генерирани от R пакета RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER беше използван за намиране на мотиви на разпределението на данни в пикови региони. Наречените пикове бяха анотирани чрез пресичане с генна и транскриптна архитектура с помощта на ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

Тест за стабилност на иРНК

Пречистени далачни NK клетки от Ythdf2ΔNK и Ythdf2WT мишки бяха култивирани с IL-15 (50 ng/ml). 3 дни след култивиране, клетките бяха третирани с актиномицин D (5 ug/ml, кат. № A9415; Sigma) за посоченото време. Клетките без третиране се използват при 0 часа. Клетките се събират в указаното време и общата РНК се екстрахира от клетките за qPCR. Полуживотът на иРНК се изчислява с помощта на метода, описан по-рано от Weng et al. (2018). Праймерните последователности са изброени в Таблица S1.

Онлайн анализ на база данни

Използвахме онлайн ресурса BioGPS (//biogps.org), за да анализираме тъканно-специфичната експресия на Ythdf2. Комплектите RNA-seqdata бяха от GEO под регистрационни номера. GSE106138, GSE113214 и GSE25672. Нормализирани данни от RNA-seq анализи бяха експортирани и z-резултатът на генната експресия беше визуализиран с функцията Heatmap.2 в gplots Rlibrary

Статистика

Несдвоените t-тестове на Student (двустранни) бяха извършени с помощта на софтуер GraphPad Prism. Еднопосочна или двупосочна ANOVA беше извършена, когато бяха сравнени три или повече независими групи. Стойностите на P бяха коригирани за множество сравнения, като се използва процедурата на Holm-Sˇ´ıdak. P < 0.05 беше счетено за значимо. *, P < {{10}}.05; **, P <0.01; и ***, P <0.001.

Онлайн допълнителен материал

Фигура S1 показва протеиновите нива на YTHDF2 в имунните клетки, включително NK клетките в отговор на IL-15 стимулация, MCMV инфекция и туморна прогресия; генерирането на мишки с NKcell-специфична делеция на Ythdf2. Фигура S2 показва вирусните титри в далака и черния дроб от мишки, заразени с MCMV, и процента и абсолютния брой на Ly49H+ и/или Ly49D+ NK клетки при мишки, заразени с MCMV. Фигура S3 показва пролиферацията, оцеляването, узряването и експресията на активиращи и инхибиторни рецептори на NK клетки от Ythdf2WT и Ythdf2ΔNK мишки. Фигура S4 показва регулирането на експресията на YTHDF2 чрез IL-15-STAT5 сигнализиране и експресията на компонентите на IL-15 рецепторите, пътя PI3K–AKT и пътя MEK–ERK в NK клетки от Ythdf2WT и Ythdf2ΔNK мишки. Фигура S5 показва анализи на RNA-seq, m6A-seq и RIP-seq в широк транскриптом в NK клетки. Таблица S1 изброява праймерите, използвани в изследването.

Наличност на данни

Данните за RNA-seq, m6A-seq и RIP-seq бяха депозирани в Националния център за биотехнологична информация GEO под номер на достъп. GSE174027. Останалите данни, които подкрепят констатациите от това проучване, са достъпни от съответните автори при поискване.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Националните институти по здравеопазване (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 и CA210087), Обществото за левкемия и лимфом (1364-19), Калифорнийския институт за регенеративна медицина (DISC2COVID{{ 9}}) и наградата за изключителен проект на Алианса за борба с рака на гърдата за 2021 г. Тази работа беше частично подкрепена и от награда на USDA (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Принос на авторите: S. Ma, J. Yu и MA Caligiuri замислиха и проектираха проекта. S. Ma, J. Yan, J. Zhang и J. Ю извършва експерименти и/или анализи на данни. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun и J. Chen допринесоха с реактиви и материална подкрепа. S. Ma, J. Yu, J. Chen и MA Caligiuri написаха, прегледаха и/или ревизираха статията. Всички автори обсъдиха резултатите и коментираха ръкописа.

Разкрития: Дж. Чен съобщи „друго“ от Genovel BiotechCorp. извън предоставената работа и е научен основател на Genovel Biotech Corp. и научен съветник по расова онкология. Не са докладвани други разкрития.

Препратки

1.Arase, H., ES Mocarski, AE Campbell, AB Hill и LL Lanier. 2002. Директно разпознаване на цитомегаловирус чрез активиране и инхибиране на NKклетъчни рецептори. Наука. 296:1323-1326.

2. Ayala, YM, T. Misteli и FE Baralle. 2008. TDP-43 регулира фосфорилирането на ретинобластомния протеин чрез потискане на експресията на циклин-зависима киназа 6. Proc. Natl. акад. Sci. САЩ. 105:3785-3789.

3. Барбиери, И., К. Целепис, Л. Пандолфини, Дж. Ши, Г. Милан-Замбрано, С. К. Робсън, ´D. Aspris, V. Migliori, AJ Bannister, N. Han и др. 2017. Свързаният с промотор METTL3 поддържа миелоидна левкемия чрез m6A-зависим контрол на транслацията. Природата. 552: 126-131.

4. Бекнел, Б. и М. А. Калиджиури. 2005. Интерлевкин-2, интерлевкин-15 и техните роли в човешките естествени клетки убийци. адв. Immunol. 86: 209–239.

5. Bertoli, C., JM Skotheim и RA de Bruin. 2013. Контрол на транскрипцията на клетъчния цикъл по време на G1 и S фазите. Нац. Rev. Mol. Cell Biol. 14: 518-528.

6. Безман, NA, CC Kim, JC Sun, G. Min-Oo, DW Hendricks, Y. Kamimura, JA Best, AW Goldrath и LL Lanier. Консорциум по проекта за имунологичен геном. 2012. Молекулярна дефиниция на идентичността и активирането на естествените клетки убийци. Нац. Immunol. 13:1000-1009.

7. Carson, WE, JG Giri, MJ Lindemann, ML Linett, M. Ahdieh, R. Paxton, D.Anderson, J. Eisenmann, K. Grabstein и MA Caligiuri. 1994. Интерлевкин (IL) 15 е нов цитокин, който активира човешки естествени клетки убийци чрез компоненти на IL-2 рецептора. J. Exp. Med. 180:1395-1403.

8. Карсън, WE, TA Fehniger, S. Haldar, K. Eckhert, MJ Lindemann, CF Lai, CM Croce, H. Baumann и MA Caligiuri. 1997. Потенциална роля за интерлевкин -15 в регулирането на оцеляването на човешки естествени клетки убийци. J. Clin. Инвестирам. 99:937-943.

9.Chan, CJ, MJ Smyth и L. Martinet. 2014. Молекулярни механизми на активиране на естествени клетки убийци в отговор на клетъчен стрес. Cell DeathDiffer. 21:5–14.

10.Chen, X., J. Han, J. Chu, L. Zhang, J. Zhang, C. Chen, L. Chen, Y. Wang, H.Wang, L. Yi и др. 2016. Комбинирана терапия на EGFR-CAR NK клетки и онколитичен херпес симплекс вирус 1 за мозъчни метастази на рак на гърдата. Oncotarget. 7: 27764-27777.

For more information:1950477648nn@gmail.com