Жизнеспособни пробиотични щамове, убити от топлина, подобряват оралния имунитет чрез повишаване на концентрацията на IgA в устната лигавица

Резюме

Имунитетът на устната и носната лигавица играе решаваща роля в защитата на тялото срещу бактериална и вирусна инвазия. Безопасни пробиотични продукти са използвани за подобряване на човешкия имунитет и оралното здраве. В това проучване ние проверихме полезните ефекти на смесени жизнеспособни пробиотични таблетки, състоящи се от Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9, и Lactobacillus paracasei ET-66, и топлинно убити пробиотични таблетки, състоящи се от L. salivarius subsp. salicinius AP-32 и L. paracasei ET-66, върху оралния имунитет сред 45 здрави участници. Участниците бяха произволно разделени на жизнеспособни пробиотици, убити от топлината пробиотици и плацебо групи. Продължителността на лечението е 4 седмици. Проби от слюнка бяха събрани на седмици 0, 2, 4 и 6 и бяха измерени популациите на Lactobacillus, Bifidobacterium и Streptococcus mutans и концентрацията на IgA. Концентрациите на IgA и нивата на TGF-бета и IL-10 в PBMC клетки се определят количествено чрез метода ELISA. Резултатите показват, че нивата на IgA в слюнката са значително повишени при прилагане на двете жизнеспособни (119,30±12,63%, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

ползи от добавката Cistanche - повишава имунитета

Въведение

Орално-носната лигавица, входната врата за контакт с инхалаторни антигени, е предната защита на човешката имунна система [1, 2]. Обикновено патогенните вируси или бактерии нахлуват в мукозните повърхности на устно-носната кухина, като се борят срещу локалната имунна система и здравата микробиота [3]. Възпалението и симптомите, включително кашлица, болки в гърлото, хрема и треска, се развиват поради имунните отговори срещу инвазивни патогенни вируси и бактерии [4]. Освен това имуноглобулин А (IgA) е основният имунен фактор в слюнката и регулира хомеостазата на оралната микробиота [5]. Няколко проучвания съобщават за способността на секреторния IgA да защитава тялото от инфекция от вирусни патогени, включително респираторен синцитиален вирус [6], ротавирус [7] и грипен вирус [7]. Секреторният IgA функционира за защита на мукозния епител. Никола Миле и др. откриха, че лигавичният IgA може да предотврати коменсалната дисбиоза на Candida albicans в устната кухина [8]. Той също така предотвратява агрегацията на оралния патоген Streptococcus mutans, който причинява зъбна плака [9].

Освен това изследователите откриха, че оралната микробиота и нейните метаболити могат локално да повлияят на имунитета на оралната бариера [10]. Предишни проучвания показват ефективността на пробиотиците при повишаване на концентрацията на IgA в устната лигавица [11]. Ericson и др. демонстрира, че дъвката, съдържаща Lactobacillus reuteri, участва в адаптивния имунен отговор на здрави индивиди чрез повишаване на нивата на IgA в слюнката [12]. При хората имунните цитокини TGF-бета и IL-10 са свързани с производството на IgA [13].

Все още обаче не е ясно дали оралната микробиота повишава секреторните нива на IgA чрез цитокините TGF-бета и IL-10. Освен това оралните патогени включват S. mutans, P. gingivalis и F. nucleatum subsp. полиморфизъм и A. actinomycetemcomitans показват висока корелация с пародонтално заболяване и лош дъх [14]. Пробиотичните продукти биха могли да бъдат потенциална алтернативна терапия на пародонтит чрез инхибиране на оралните патогени Fusobacterium nucleatum, но Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans не показват значително намаление [15]. Пробиотичните добавки могат също да предотвратят патогенни инфекции [16]. Съобщава се, че ключови видове от микробиотата ограничават растежа на патогенната Streptococcus пневмония [17]. По този начин поддържането на балансирана микробна екосистема чрез усвояването на пробиотични щамове може да бъде алтернативен начин за регулиране на оралния имунитет и подобряване на оралното здраве. Предишни открития относно инхибирането на орални патогени от пробиотични щамове разкриха, че Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9 и Lactobacillus paracasei ET-66 проявяват отлични антибактериални ефекти in vitro; но не чрез механизма на повишаване на нивата на H2O2 [18]. Основните стратегии за пробиотичните щамове за ограничаване на оралния патогенен растеж са ко-агрегирането на патогени през устата, производството на биосърфактанти, промяна на оралната среда и генериране на антимикробни вещества [19]. Освен това, in vitro проучване показа, че L. salicinius AP-32 медиира експресията на възпалителен цитокин [интерлевкин (IL)-8, IL-10] в човешки епителни клетки [20]. Следователно, в това проучване, ние проверихме дали смесените жизнеспособни пробиотични таблетки, състоящи се от L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9, и L. paracasei ET-66, и топлинно убити пробиотични таблетки, състоящи се от L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 и L. paracasei ET-66, подобряват имунната функция чрез TGF-бета, IL-10 или повишават нивото на концентрацията на IgA в слюнката. Тествана е антибактериалната функция на усвояването на пробиотичните продукти в устната кухина.

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Щракнете тук, за да видите продуктите Cistanche Enhance Imunity

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Материали и методи

Участници

Общо 45 здрави участници на възраст 20–40 години бяха наети и разделени на случаен принцип в три подгрупи: жизнеспособни пробиотични перорални таблетки, пробиотични перорални таблетки, убити от топлина, и плацебо групи. Всяка група се състоеше от 15 участници. Участниците с тютюнопушене и хранителни навици с бетелови ядки бяха изключени. Таблетките за перорално приложение бяха разпределени на сляпо на участниците. Всички участници приемаха пероралните таблетки три пъти на ден (сутрин, обед и вечер) в продължение на 4 седмици. Бяха събрани проби от слюнка (2 mL) за измерване на концентрацията на IgA и популациите на микроорганизми на седмици 0, 2, 4 и 6. Беше получено информирано съгласие от всички участници, включени в това проучване. Протоколът е одобрен от институционалния съвет за преглед на медицинския университет Chung Shan, Тайван (CS19052).

Жизнеспособни пробиотични перорални таблетки

Жизнеспособната пробиотична перорална таблетка (1 g) съдържа три жизнеспособни пробиотични щама, L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9 и L. paracasei ET-66. Смесихме 0.01 g от 1011 единици за образуване на колонии (CFUs) единичен пробиотик в пероралната таблетка. Всеки отделен пробиотичен щам е измерен около 0,33 * 109CFUs/g. Общото съдържание на пробиотик в пероралната таблетка е 109 колонии CFUs/g. Активната дозировка на пробиотичната перорална таблетка е след предишни публикувани трудове [18]. Всички пробиотични щамове са получени от лабораторията на Biofag Biotech Co., Ltd. (Тайнан, Тайван). L. salivarius subsp. salicinius AP-32 е изолиран от здрави човешки черва и депозиран в Института за изследване и развитие на хранителната промишленост, Тайван (ID: BCRC 910437) и в Университета на Ухан, Китай (ID: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. lactic CP-9 е изолиран от здравословно човешко майчино мляко и депозиран в Института за изследване и развитие на хранителната промишленост, Тайван (ID: BCRC 910645) и в университета на Ухан (ID: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 е изолиран от здравословно човешко майчино мляко и депозиран в Института за изследване и развитие на хранително-вкусовата промишленост, Тайван (ID: BCRC 910753) и в Общия център за събиране на микробиологични култури в Китай, Пекин, Китай (ID: CGMCC{ {22}}). Лактобацилус. salivarius subsp. salicinius AP-32 и L. paracasei ET-66 се култивират върху де Ман, Рогоза и Шарп (MRS) агарни плаки (110 660, Merck, Дармщат, Германия) и се инкубират при факултативни анаеробни условия при 37 градуса за 48 ч. B. animalis subsp. Lactis CP-9 се култивира върху MRS агар, допълнен с 0,05% цистеин и анаеробно инкубиран при 37 градуса за 48 часа. Извършено е преброяване на колониите за количествено определяне на бактериалната CFU след култивиране на пробиотични щамове [18].

растение цистанче, повишаващо имунната система

Унищожени от топлина пробиотични перорални таблетки

Убитите чрез топлина пробиотични перорални таблетки (1 g) се състоят от инактивиран L. salivarius subsp. salicinius AP-32 и L. paracasei ET-66. Жизнеспособните щамове се култивират и инкубират, както е описано по-горе. След това AP-32 и ET-66 бяха инактивирани чрез инкубиране на жизнеспособните щамове в MRS среда при 100 градуса за 1 час. Съдържанието на пробиотик в пероралната таблетка е 1 × 1010 клетки/g. Активната доза на топлинно убити пробиотични перорални таблетки е след публикувано преди това in vitro тестване [11]. Всички експериментални процедури бяха извършени в лабораторията на Biofag Biotech Co., Ltd. (Тайнан, Тайван).

Измерване на популациите на Lactobacillus и Bifidobacterium в проби от слюнка

Проби от слюнка (2 mL) бяха събрани от всеки участник на седмици 0, 2, 4 и 6. Пробите от слюнка (100 µL) бяха серийно разредени и добавени към MRS чинии. За измерване на популациите на Lactobacillus, Lactobacillus се култивира и инкубира върху MRS агарови плаки при факултативни анаеробни условия при 37 градуса за 48 часа. За измерване на популациите на Bifdobacterium, Bifdobacterium се култивира и инкубира анаеробно върху MRS агар, допълнен с 0.05% цистеин при 37 градуса за 48 часа. Извършено е преброяване на колониите за количествено определяне на бактериалната CFU след култивиране на пробиотични щамове. Степента на популация на Lactobacillus и Bifidobacterium се нормализира към броя на популацията на пробиотиците на седмица 0. Степента на популация на Lactobacillus и Bifidobacterium, събрана на седмица 0, се счита за 100%. Експерименталният метод следва публикувани преди това работи [18].

Измерване на концентрацията на IgA в устната лигавица

Проби от слюнка (2 mL) бяха събрани от всеки участник на седмици 0, 2, 4 и 6 и се поддържаха при 20 градуса. IgA човешки Uncoated ELISA комплект (Каталог # 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) беше използван за анализ на концентрацията на IgA. Първо, покрихме анти-човешки IgA антитела върху 96-плака с ямки. Слюнчен IgA, присъстващ в пробата или стандарта, се добавя към микроямката и след това HRP-конюгирано анти-човешко IgA антитяло се добавя при стайна температура за 1 час. Пипетирайте TMB субстрат във всяка ямка за 30 минути. Накрая, концентрацията на IgA се измерва на спектрофотометър при 450 nm. Цялата експериментална процедура беше извършена в три екземпляра, съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията на IgA, събрана на седмица 0, се счита за 100%. Експерименталният метод следва публикувани преди това работи [18].

cistanche tubulosa - подобряват имунната система

Измерване на концентрацията на TGF-бета и IL-10 в PBMC

Тестване на предизвикано от пробиотиците повишаване на нивата на TGF-бета и IL-10 след предишното проучване [20]. Мононуклеарните клетки на периферната кръв (PBMC) са получени от кръвни проби на здрави донори (Кръвен център на Тайнан, Фондация за кръвни служби на Тайван). Центрофугиране на цяла кръв през градиент на Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Швеция) и фракцията със светлинна плътност от 42,5%-50% интерфейс се елуира. Посяване на 4 * 105 клетъчно екстрахирани PBMC клетки в 100 ul RPMI-1640 с 1% FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) във всяка ямка на 96-ямкови плаки. След това добавяне на 5 * 105 cfu/20 µl пробиотично третиране към всяка PBMCs засета ямка (клетки: пробиотични щамове=1:10). Положителните контроли добавяха 10 µg/ml фитохемаглутинин (PHA) (Sigma-Aldrich, Мюнхен, Германия) към PBMCs посяти ямки за производството на TGF-, IL-10 съответно [21]. Съвместно култивиране на пробиотици с PBMC за 48 часа. Измерване на супернатанта, съдържаща цитокини IL-10 и TGF- чрез анализ на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (Thermo Scientific, Карлсбад, Калифорния, САЩ). Всички експерименти бяха измерени и следваха търговския протокол поне в три екземпляра.

Оценка на антибактериалната функция в устната кухина

Streptococcus mutans е често срещана заплаха за оралното здраве, която причинява зъбен кариес чрез образуване на чума или биофилм [22]. Бяха събрани проби от Streptococcus mutans от тампоните, чрез които събрахме S. mutans върху супрагингивалната част, гингивата и устната лигавица, на седмици 0, 2, 4 и 6. S. mutans се поддържаше в триптик соев бульон (TSB, 5 mL), допълнен с 50% глицерол. Средата на S. mutans беше серийно разредена и добавена към блюдо Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL), което беше инкубирано при 37 градуса за 2 d. Накрая, броят на колониите S. mutans във всяка проба от участници беше преброен, за да се изчислят нивата на патогенна преживяемост; степента на преживяемост на S. mutans, събрана на седмица 0, се счита за 100%. Експерименталният метод следва публикувани преди това работи [18].

In vitro антибактериална активност на пероралните таблетки

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFUs) пробиотични щамове се разтварят съответно в TSB и среда за инфузия на мозъчно сърце, за да се получи крайна концентрация от 0,1 g/mL. Само средата се използва за празната група, докато таблетки (1 g) без никакви пробиотични компоненти се разтварят в съответната среда за плацебо групата. След това оралните патогени (106 CFUs) се въвеждат в разтворите на таблетката и се инкубират съвместно при 37 градуса за 2 (S. mutans) или 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum и Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) d. Патогените са получени от BCRC. Степента на инхибиране на оралния патоген (%) се изчислява, както следва: (CFU празна контрола – CFU експериментална група)/CFU празна контрола. Експерименталният метод следва предишни публикувани тестове [11].

Статистически анализ

Софтуерът GraphPad Prism беше използван за статистически анализ на резултатите от двустранен t-тест. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD) или средна стойност на резултатите от два или три независими експеримента. Статистическите разлики се считат за значими при P стойност<0.05.

Резултати

Пробиотичните таблетки увеличават популацията на бифидобактериите в устната кухина

Популацията на Bifidobacterium е стабилно повишена в устната кухина след прилагане на пробиотични таблетки. Бактериалните популации след третиране бяха нормализирани от бактериалните популации преди третирането (процент на популация %=CFU след третиране/CFU преди третиране). В групата с жизнеспособни пробиотици процентът на популацията се е увеличил значително до 244,14±164,96% на седмица 2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Пробиотичните таблетки увеличават популацията на Lactobacillus в устната кухина

Промяната в оралната популация на Lactobacillus, дължаща се на прилагане на пробиотични таблетки, разкрива модел, подобен на този, последван от промяната в оралната популация на Bifidobacterium. Бактериалните популации след третирането се нормализират от бактериалните популации преди третирането. В групата с жизнеспособни пробиотици нивото на популацията на Lactobacillus значително се е увеличило до 447,74±337,89% на седмица 2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Фиг. 1 a Измерване на популациите на Bifidobacterium върху повърхностите на устната лигавица. V жизнеспособни пробиотични таблетки; H топлинно убити инактивирани пробиотични таблетки; C плацебо таблетки (контрола); и LAB млечнокисели бактерии. Бяха извършени събиране и анализ на проби от слюнка на седмици 0, 2, 4 и 6. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD). Използван е двустранен t-тест за анализиране на статистически разлики. Статистическата значимост беше отбелязана с *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Пробиотични таблетки, съдържащи AP-32, ET-66 и CP-9 значително повишават концентрацията на IgA в устната лигавица

Тъй като е доказано, че консумацията на пробиотични таблетки (жизнеспособни или убити от топлина) повишава нивата на Bifidobacterium и Lactobacillus в устната кухина, ние допълнително анализирахме промените в концентрацията на IgA в слюнката, настъпили поради усвояването на пробиотичните продукти. Нивата на IgA след лечението се нормализират от нивата на IgA преди лечението. В групата с жизнеспособни пробиотици концентрацията на IgA в слюнката леко се повишава до 103,24 ± 8,10% на седмица 2 (фиг. 2) и 104,81 ± 13,26 на седмица 4, но без статистически значими разлики. Въпреки това концентрацията на IgA в слюнката в групата на жизнеспособни пробиотици, в сравнение с групата на плацебо, е значително повишена до 119,30 ± 12,63% на седмица 6 (без прилагане на таблетки с жизнеспособни пробиотици в продължение на 2 седмици след седмица 4), в сравнение със седмица 0 ( ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Жизнеспособни щамове повишават нивата на IL-10 и TGF-бета в PBMCs

Положителната контрола на 10 µg/ml фитохемаглутинин (PHA) успешно повиши нивата на IL-10 (58.2 ± 7.9 pg/ml, ***P <0.001, Фиг. 3a) и TGF- (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Фиг. 2 Концентрация на имуноглобулин А (IgA) в пробите от слюнка. V жизнеспособни пробиотични таблетки; H топлинно убити инактивирани пробиотични таблетки; C плацебо таблетки (контрола); и LAB млечнокисели бактерии. Бяха извършени събиране и анализ на проби от слюнка на седмици 0, 2, 4 и 6. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD). Използван е двустранен t-тест за анализиране на статистически разлики. Статистически

Пробиотичните таблетки, съдържащи AP-32, ET-66 и CP-9, забраняват популацията на S. mutans в слюнката

Повишените популации на Bifidobacterium и Lactobacillus и повишената концентрация на IgA в слюнката могат да допринесат за борбата срещу оралните патогенни микроорганизми. В последвалия експеримент тествахме промяната в популацията на оралния патоген S. mutans, дължаща се на пробиотична интервенция. Бактериалните популации след третирането се нормализират от бактериалните популации преди третирането. В групата с жизнеспособни пробиотици, популацията на S. mutans беше значително намалена на седмица 2 (53,55±31,60%, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Фиг. 3 Жизнеспособни щамове повишават нивата на IL-10 и TGF-бета в PBMC. Нивото на IL-10 и b TGF-бета в PBMCs бяха тествани чрез третиране на пробиотични щамове. Добавяне на 5 * 105 cfu/20 µl жизнеспособни щамове на CP-9, AP-32 и ET-66 към PMBCs 10 µg/ml. Фитохемаглутининът (PHA) се използва като положителна контрола. Отрицателната контрола беше PBMCs, третирани само със среда RMPI-1640. Проведени са трикратни тестове. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD). Използван е двустранен t-тест за анализиране на статистически разлики. Статистическата значимост беше отбелязана с P<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Фиг. 4 Измерване на популации на патогенни Streptococcus mutans върху повърхностите на устната лигавица. V жизнеспособни пробиотични таблетки; H топлинно убити инактивирани пробиотични таблетки; C плацебо таблетки (контрола); и LAB млечнокисели бактерии. Бяха извършени събиране и анализ на проби от слюнка на седмици 0, 2, 4 и 6. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD). Използван е двустранен t-тест за анализиране на статистически разлики. Статистическата значимост беше отбелязана с *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Потвърждение на способността на пробиотичните таблетки да инхибират растежа на оралните патогени чрез ин витро тест

Проучването in vitro разкрива, че жизнеспособните пробиотични таблетки значително инхибират степента на преживяемост на оралните патогени (фиг. 5а). Бактериалните популации след третирането се нормализират от бактериалните популации преди третирането. Степента на преживяемост на S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum и A. actinomy cetemcomitans в групата с жизнеспособни пробиотици, в сравнение с групата на плацебо, е намалена до 4,23% (***P < 0 .001, плацебо=91%), 8,64% (***P < 0,001, плацебо=89%), 5,77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Дискусия

В сравнение с групата на плацебо, пероралните популации на Lactobacillus и Bifidobacterium биха се увеличили значително чрез хранене с жизнеспособни пробиотични таблетки или убити чрез топлина пробиотични таблетки за 4 седмици. Освен това, броят на Lactobacillus и Bifidobacterium остава на значително високи нива в продължение на 2 седмици след спиране на консумацията на прием на жизнеспособни пробиотици (фиг. 1a и b). По същия начин Camila Casuccio Almeida et al. демонстрира, че четириседмично прилагане на пробиотично лечение може да продължи да подобрява симптомите при пациенти с непоносимост към лактоза най-малко 3 месеца след спиране на приема на пробиотици [23]. Въпреки това, продължаващият ефект на пробиотиците при дългосрочно лечение трябва да бъде оценен в бъдеще. Освен това, концентрацията на IgA в слюнката беше значително повишена при прилагането на жизнеспособни пробиотични таблетки, убити от топлина. Както убитите чрез топлина, така и жизнеспособните пробиотични групи повишиха слюнчения IgA чрез прилагане на перорални таблетки в продължение на 4 седмици, но без да показват статистическа разлика спрямо плацебо. Концентрацията на IgA в топлинно убитите и жизнеспособни пробиотични групи показва значително увеличение на седмица 6. Въпреки това, механизмът на повишаване на IgA след прекратяване на прилагането на пробиотици за 2 седмици трябва да бъде изследван допълнително (фиг. 2) Braathen et al. докладват подобни резултати за имуномодулиращата роля на пробиотичните щамове в устната кухина [24]. Освен това се съобщава, че пробиотичните щамове повишават значително концентрацията на IgA във фекалиите при свине майки и прасенца [25]. Въпреки това, проучванията върху IgA-облекчаващите симптоми при инфекции на горните дихателни пътища остават недостатъчни. Подробният молекулен механизъм на инхибиране и превенция на инфекции на горните дихателни пътища от пробиотични щамове CP-9, AP-32 и ET-66 може да бъде изследван в бъдещи проучвания. В настоящото изследване жизнеспособни щамове CP-9, AP-32 и ET-66 биха повишили нивото на IL-10 и TFG-бета в PBMC клетки. AP-32 показа ефективна способност за увеличаване на IL-10 и TFG-бета в PBMCs чрез сравняването им с PHA положителна контрола (фиг. 3a и b). Предполага се, че жизнеспособните щамове CP-9, AP-32 и ET-66 могат да индуцират В-клетките, секретиращи IL-10 и TFG-бета, за да повишат нивата на IgA в слюнката. Въпреки това, корелацията между слюнчен IL-10, TFG-бета и слюнчен IgA трябва да бъде тествана допълнително [26]. Освен това все още не е ясно дали пробиотиците, убити от топлина, повишават IgA чрез индуциране на IL-10 и TFG-бета. In vitro тест показва, че убитият от топлина AP-32 насърчава секрецията на интерферон и IL-12p70 и намалява нивата на IL-13 [27]. По този начин, в това клинично проучване, способността на пробиотичните CP-9, AP-32 и ET-66 щамове и топлинно убиват AP-32 и ET-66 щамовете за инхибиране на патогенни бактерии в устната кухина бяха допълнително валидирани (фиг. 4). Жизнеспособните пробиотични таблетки за смучене показват по-добра антипатогенна способност от таблетките за смучене, унищожени от топлина, чрез секретиране на органични киселини, антимикробни пептиди [28], екзополизахариди (EPS) [29] бактериоцини [30] (фиг. 5a и b). Функционалните антимикробни компоненти, произведени от жизнеспособни пробиотични щамове, трябва да бъдат открити чрез високоефективна течна хроматография (HPLC) и течна хроматография (LC) – масспектрометрия в бъдеще [31]. Съобщава се, че убитите чрез топлина пробиотици притежават ключови предимства на жизнеспособните пробиотици, но без някои опасения за безопасността на жизнеспособните пробиотични щамове [32]. Въпреки това, антимикробните компоненти на убитите чрез топлина пробиотици трябва да бъдат допълнително проверени.

Фиг. 5 Потвърждение на способността на пробиотичните таблетки да инхибират растежа на оралните патогени чрез in vitro тест. Способността на жизнеспособни пробиотични таблетки, убити от топлина, да инхибират степента на оцеляване на орални патогени, включително Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, беше валидирана. Празна група, само средна; плацебо група, таблетки (1 g) без никакви пробиотични компоненти. Проведени са трикратни тестове. Данните бяха представени като средно стандартно отклонение (SD). Използван е двустранен t-тест за анализиране на статистически разлики. Статистическата значимост беше отбелязана с *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Заключение

Смесени жизнеспособни пробиотични таблетки, състоящи се от L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactic CP-9, и L. paracasei ET-66, и пробиотици, убити от топлина, включително L. salivarius subsp. salicinius AP-32 и L. paracasei ET-66, упражняват своите полезни функции чрез повишаване на оралните популации на Lactobacillus и Bifdobacterium, намаляване на S. mutans в устната кухина и увеличаване на концентрацията на IgA в слюнката при здрави участници. Резултатите от теста in vitro потвърдиха, че жизнеспособните пробиотици ефективно инхибират оралните патогени, включително S. mutans, P. gingivalis и F. nucleatum subsp. полиморфизъм и A. actinomycetemcomitans. Имунитетът на устната и носната лигавица е защитата на първа линия срещу нахлуващи микроорганизми и това се превърна в решаващ въпрос. По този начин това проучване ще предложи алтернативна стратегия (пробиотична добавка) за поддържане на оралния имунитет и оралното здраве.

Ползи от добавката Cistanche - как да подсилим имунната система

Препратки

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Мукозен имунен отговор в свързаната с носа лимфоидна тъкан при интраназално приложение от адюванти. J Innate Immun 10 (5–6): 515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) Мукозната имунна система в устната кухина - оркестър от Т-клетъчно разнообразие. Int J Oral Sci 6(3):125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) Микробиотата на респираторния тракт: вратар към респираторното здраве. Nat Rev Microbiol 15(5):259–270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Инфекции на горните дихателни пътища при малки деца: продължителност и честота на усложненията. Педиатрия 87 (2): 129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Орална микробна екология и ролята на слюнчения имуноглобулин А. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71–109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G et al (1996) Интраназално моноклонално IgA антитяло срещу респираторен синцитиален вирус предпазва маймуните резус от инфекция на горните и долните дихателни пътища. J Infect Dis 174(2):256–261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Антиротавирусният имуноглобулин А неутрализира вируса in vitro след трансцитоза през епителни клетки и предпазва малките мишки от диария. J virol 72(4):2708–2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) Мукозен IgA предотвратява комензалната дисбиоза на Candida albicans в устната кухина. Front Imunol 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) Защитен отговор на слюнчен имуноглобулин А срещу инфекция със Streptococcus mutans след интраназална имунизация с антиген I/II на S. mutans, свързан с B субединицата на холерен токсин . Infect Immun 61(5):1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Тъканно-специфичен имунитет при оралната мукозна бариера. Тенденции Immunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Пастили с пробиотични щамове подобряват оралния имунен отговор и здравето . Oral Dis. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Слюнчен IgA отговор на пробиотични бактерии и mutans стрептококи след употреба на дъвка, съдържаща Lactobacillus reuteri. Pathog Dis 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Интерлевкин 10 и трансформиращият растежен фактор бета си сътрудничат, за да индуцират анти-CD40-активирани наивни човешки В клетки да секретират имуноглобулин А. J Exp Med 175 (3): 671–682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) Откриване и разпространение на пародонтални патогени в уругвайска популация с хроничен пародонтит, използвайки конвенционална методология и метагеномика. Odontoestomatologia 17 (25): 23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Пробиотична алтернатива на хлорхексидин в пародонталната терапия: оценка на клинични и микробиологични параметри. Микроорганизми 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y et al (2016) Пробиотици за превенция и лечение на инфекции на дихателните пътища при деца: систематичен преглед и мета-анализ на рандомизирани контролирани проучвания. Медицина 95 (31): e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Микробни общности на горните дихателни пътища и възпаление на средното ухо при деца. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.00245-10

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Антибактериална активност на жизнеспособни и убити от топлина пробиотични щамове срещу орални патогени. Lett Appl Microbiol 70(4):310–317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Пробиотици за орално здраве: мит или реалност? J Can Dent Assoc 75 (8): 585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) Потенциал на пробиотичните щамове за модулиране на възпалителните реакции на епителните и имунните клетки in vitro. New Microbiol 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) Производството на TGF- и IL-10 от HIV-специфични CD8+ Т клетки се регулира от CTLA{ {5}} сигнализиране на CD4+ Т клетки. PloS ONE 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: Станал ли е основен извършител на орални прояви? J Microbiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Благоприятните ефекти от дългосрочната консумация на пробиотична комбинация от Lactobacillus casei Shirota и Bifidobacterium breve Yakult могат да продължат след спиране на терапията при пациенти с непоносимост към лактоза. Nutr Clin Pract 27 (2): 247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) Наличието на Lactobacillus reuteri в слюнката съвпада с по-висок слюнчен IgA при млади възрастни след прием на пробиотични таблетки за смучене. Benef Microbes 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Въздействие на пробиотичните бактерии Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) и Bacillus cereus var. към вас NCIMB 40112 за развитието на серумен IgG и фекален IgA на свине майки и техните прасенца. Arch Anim Nutr 61 (4): 223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Ефекти на пробиотиците върху слюнчените цитокини и имуноглобулини: систематичен преглед и мета-анализ на клинични изпитвания. Sci Rep 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Убитите от топлина млечнокисели бактерии повишават имуномодулиращия потенциал чрез изкривяване на имунния отговор към Th1 поляризацията. J Food Sci 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Антивирулентни свойства на пробиотиците в борбата с микробната патогенеза. Adv Appl Microbiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Екзополизахаридни дейности от пробиотични бифидобактерии: Имуномодулиращи ефекти (върху J774A.1 макрофаги) и антимикробни свойства. Int J Food Microbiol 144(1):104–110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) Откриване и активност на лактацин B, бактериоцин, произведен от Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Характеризиране и структурна идентификация на антимикробен пептид, хоминин, произведен от Staphylococcus hominis MBBL 2–9. Biochem Biophys Res Commun 399 (2): 133–138

32. Piqué N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Ползи за здравето на пробиотици, убити чрез топлина (тиндализирани): преглед. Int J Mol Sci 20(10):2534