Фарнезилтрансферазният инхибитор LNK-754 отслабва аксоналната дистрофия и намалява амилоидната патология при мишки, част 3

Резултати

Намалено натоварване с амилоидни плаки и тау хиперфосфорилиране в мозъците на LNK-754-хронично лекувани 5XFAD мишки

LNK-754 и лонафарниб са FTI с малки молекули, които преди това са били тествани при хора в клинични проучвания за рак и е известно, че преминават кръвно-мозъчната бариера [8, 9, 41, 42]. -синуклеин [8] и тау включвания [9] се редуцират съответно от LNK-754 и лонафарниб, но все още не са оценени спрямо амилоидния фенотип на AD. В това проучване ние изследвахме техните ефекти върху амилоидната патология в модела на мишка 5XFAD. 5XFAD мишки развиват А отлагания, започващи на 2-месечна възраст [36, 37], а дистрофични неврити се наблюдават в най-ранните етапи на амилоидно отлагане [39, 43].

Кръвно-мозъчната бариера и имунитетът са две много важни части от човешкото тяло и те са неразривно свързани. Кръвно-мозъчната бариера е защитна бариера между мозъка и кръвта, която предпазва мозъка от вредни вещества отвън. Имунитетът е важен механизъм за човешкото тяло да устои на болести. И така, каква е специфичната връзка между кръвно-мозъчната бариера и имунитета?

Първо, кръвно-мозъчната бариера може да предотврати навлизането на някои вредни бактерии и вируси в мозъка, като по този начин предпазва мозъка от увреждане. В допълнение, кръвно-мозъчната бариера може също така да контролира пропускливостта на определени вещества, позволявайки им да навлязат в мозъка само в ограничена степен. Това е от решаващо значение за защитата на здравето на нервната система, тъй като твърде много от някои вътрешни вещества, навлизащи в мозъка, могат да причинят увреждане на нервните клетки.

В същото време имунитетът също може да играе роля в защитата на мозъка. Имунната система на човешкото тяло може да разпознае патогени и вредни вещества и след това да произведе съответните антитела, за да устои на тяхната инвазия, като по този начин предпазва тялото от болести. Въпреки това, когато определени патогени или вещества преминат кръвно-мозъчната бариера и навлязат в мозъка, имунната система реагира бързо и произвежда антитела, за да ги атакува и елиминира.

Следователно кръвно-мозъчната бариера и имунитетът играят много важна роля за поддържане на човешкото здраве. Кръвно-мозъчната бариера предотвратява навлизането на вредни вещества в мозъка, докато имунитетът премахва патогени и други вредни вещества, които заобикалят кръвно-мозъчната бариера и навлизат в мозъка. Двамата работят заедно, за да осигурят здравословното функциониране на мозъка.

В обобщение, кръвно-мозъчната бариера и имунитетът си сътрудничат чрез съответните си механизми, за да играят важна роля за човешкото здраве. Трябва да се съсредоточим върху защитата на тяхното здраве, за да гарантираме цялостното здраве на тялото. Вижда се, че трябва да подобрим паметта си. Cistanche deserticola може значително да подобри паметта, тъй като Cistanche deserticola е традиционен китайски лекарствен материал с много уникални ефекти, един от които е да подобрява паметта. Ефикасността на мляното месо идва от многото активни съставки, които съдържа, включително киселина, полизахариди, флавоноиди и др. Тези съставки могат да насърчат здравето на мозъка по различни начини.

Щракнете върху познайте добавките за подобряване на паметта

Следователно, за да съвпадне с развитието на амилоидна патология при 5XFAD мишки, ние лекувахме мишки хронично в продължение на 3 месеца с носител, LNK-754 и лонафарниб, започвайки на 2-месечна възраст. LNK-754 и лонафарниб се разтварят в носител от 0.5% натриева карбоксиметилцелулоза и интраперитонеално се инжектират ежедневно с доза от 1 mg/kg [8, 44].

Първо се опитахме да определим ефектите от хроничното лечение с LNK-754 и лонафарниб върху натоварването на плака с A при 5XFAD мишки чрез имунофлуоресцентна микроскопия за A 42, която открива както дифузен, така и агрегиран амилоид и Tiazine Red (TR), която открива само фибриларна плака сърцевини (фиг. 1A; фиг. S1). Установихме значително намаление на покритата площ в кортикалните мозъчни региони на мишки, третирани с LNK754-, в сравнение с контролите, третирани с носител (фиг. 1B). В хипокампуса покритата площ е значително намалена при мишките, третирани с LNK-754-, в сравнение с мишките, третирани с лонафарниб, и има тенденция към намаляване при мишките, третирани с LNK-754, в сравнение с тези, третирани с носител (фиг. 1C).

Покрита зона 42 при мишки, третирани с лонафарниб, не се различава значително от мишки, третирани с носител, както в кората, така и в хипокампуса (фиг. 1A, B). Размерът на плаката е намален в кортикалните и хипокампалните области на мозъка чрез лечение с LNK-754 в сравнение с лечението с носител; тази разлика е статистически значима в хипокампуса (фиг. 1D, E; фиг. S2A, B). Значителна разлика в размера на плаките между лечението с лонафарниб и LNK-754 също се наблюдава в хипокампуса (Фиг. 1D, E; Фиг. S2A, B).

Размерът на плаката е непроменен при мишки, третирани с лонафарниб, в сравнение с мишки, третирани с носител в кортикални или хипокампални области на мозъка (Фиг. 1D, E; Фиг. S2A, B). Посяването на плака се определя количествено чрез анализиране на броя на плаките чрез TR оцветяване. Броят на плаките значително намалява в кората, но не и в хипокампуса, на LNK-754 в сравнение с мишките, третирани с носител (фиг. S2C, D). Намаленото натоварване на плака се потвърждава чрез измерване на А 42 чрез ELISA в PBS и гуанидин-разтворими хемимозъчни хомогенати (Фиг. 1F, G). Подобно на нашите резултати от имунофлуоресцентна микроскопия, имаше тенденция към по-малко A 42 в гуанидин и PBS фракции при третирани с лонафарниб мишки, докато значително по-ниско ниво на A 42 в гуанидинови фракции беше постигнато с LNK-754 лечение (фиг. 1. F, G).

Тъй като са докладвани въз основа на пола ефекти в модела на мишка 5XFAD за нива на АРР в стационарно състояние и натоварване с плаки [45, 46], ние извършихме имуноблотинги на мъжки и женски мишки, третирани с носител, LNK-754 или лонафарниб поотделно за трансгенна експресия на АРР (фиг. S3A). Нивата на трансгенен АРР бяха измерени чрез имуноблот с антитялото АРР 6E10, което разпознава само човешки АРР, и бяха непроменени при мъжки или женски мишки, третирани с LNK-754, лонафарниб или носител (фиг. S3B-D). Втора определяща характеристика на AD е наличието на хиперфосфорилирани тау включвания в мозъка и заедно с отлагането на плака, ендогенният миши тау е хиперфосфорилиран в 5XFAD мишки [47, 48].

За да се определи дали tau хиперфосфорилирането е повлияно от лечението с FTI в амилоиден миши модел, беше извършен имуноблот анализ за фосфо-тау при серин 404 (Фиг. 1H; Фиг. S3E), епитоп, за който е известно, че е хиперфосфорилиран в AD мозъци и 5XFAD мишки [ 47, 49]. Тук открихме намалени нива на фосфо-тау ser404 в мозъците на мишки, третирани с лонафарниб и LNK-754 (Фиг. 1I), докато общото ниво на тау остава непроменено (Фиг. 1J; Фиг. S3F). Като цяло нашите резултати разкриват, че натоварването на амилоидната плака и патогенното тау фосфорилиране са намалени в 5XFAD миши модел чрез фармакологично лечение с FTI, въпреки че лечението с LNK-754 е значително по-мощно от лонафарниб.

Хроничното лечение с LNK-754 инхибира протеиновото фарнезилиране в мозъците на 5XFAD мишки

За да потвърдим, че насочването към FTase с LNK-754 и лонафарниб чрез интраперитонеална инжекция инхибира протеиновото фарнезилиране в мозъците на 5XFAD мишки, ние оценихме различни FTase субстрати и маркери надолу по веригата за инхибиране на FTase в хемимозъчни хомогенати на 5XFAD мишки, хронично третирани с носител, LNK -754 или лонафарниб чрез имуноблот анализ. Първо анализирахме преламин А, който се натрупва, когато FTase се инхибира [50]. Наблюдава се увеличение на преламин А в мозъците на мишки, третирани с LNK-754 в сравнение с носителя, докато не е настъпила промяна при мишки, третирани с лонафарниб (фиг. S4A, D). След това разгледахме HDJ-2, протеин-шаперон, който претърпява изместване на мобилността нагоре след лечение с FTI и се използва широко като маркер за инхибиране на FTase [50]. В съответствие с преламин А, по-бавно мигрираща форма на HDJ-2 присъства в мишки, третирани с LNK-754-, но не и в мишки, третирани с лонафарниб (фиг. S4B, E). Значително увеличение на по-бавно мигриращите видове HDJ-2 е установено при мишки LNK754 в сравнение с мишки, третирани с носител или лонафарниб (фиг. S4E).

В допълнение, фарнезилирането активира Ras, така че ние също измерваме фосфорилирането на неговата ефекторна молекула надолу по веригата ERK1 (P44/P42) (фиг. S4C). Докато HDJ-2 и преламин А са непроменени от лечението с лонафарниб, се наблюдава тенденция към намален pERK1 (фиг. S4F). pERK1 също беше намален при мишки, третирани с LNK-754 (фиг. S4F). Нашите резултати показват, че 1 mg/kg LNK-754 инхибира FTase в мозъка, но лонафарниб е по-малко ефективен. Това може да се дължи на по-ниската ефикасност и IC50 на лонафарниб, както е показано по-рано [41, 51], или евентуално намалена експозиция на мозъка.

Намалено натрупване на LAMP1 в дистрофични неврити при LNK-754 хронично лекувани 5XFAD мишки

В здравите неврони лизозомните компоненти се доставят до ендозоми и автофагични органели в дисталните неврити, които се подкисляват и узряват по време на ретрограден трафик към невронната сома [52, 53]. Амилоидните плаки нарушават този процес, което води до дистрофични неврити, които улавят дисфункционалните автофагични и ендолизозомни органели.

Дистрофичните неврити блокират аксоналния транспорт на BACE1, което води до генериране на А в рамките на дистрофични неврити и отлагане на извънклетъчна плака [16–18]. Известно е, че FTI подобряват лизозомната функция и стабилността на микротубулите, така че за по-нататъшно изследване как FTI намаляват тежестта на плаката, ние се фокусирахме специално върху дистрофичните неврити в 5XFAD мишки.

За количествено определяне на натрупването на дистрофични неврити около плаките, ние оценихме лизозомно-асоциирания мембранен протеин 1 (LAMP1), маркер на хетерогенни ендолизозомни и автофагични органели. Хипокампални и кортикални мозъчни тъкани от 5XFAD мишки, третирани с носител, LNK-754 и лонафарниб, бяха съвместно оцветени за LAMP1 и A 42 и беше извършена конфокална имунофлуоресцентна микроскопия (фиг. 2A, B).
Беше зададен праг за елиминиране на LAMP1 флуоресцентни сигнали от везикули в здрави неврити и соми, за да се анализират специфично дистрофичните неврити. Покритата площ с LAMP1 е значително намалена в кортикалните и хипокампалните области на мозъка на мишки, третирани с LNK-754 (Фигура 2C, D), докато не е наблюдавана разлика при мишки, третирани с лонафарниб, в сравнение с третирани с носител (Фигура 2C, D) . Отлагането на амилоидни плаки инициира развитието на дистрофии в близките неврити, главно аксони и пресинаптични терминали.

Съответно, ефектите на LNK-754 и лонафарниб върху дистрофичните неврити са в съответствие с ефектите им върху натоварването на плаката (фиг. 1). Допълнителен анализ на ефекта от лечението с FTI върху дистрофични неврити беше извършен чрез количествено определяне на съотношението на LAMP1 покритата площ към A 42 зоната, за да се определи дали FTIs ограничават размера на дистрофията около плаките. Наблюдава се намаление в съотношението на LAMP1: A 42 за мишки, третирани с LNK-754, в сравнение с мишки с носител, а леченията с LNK-754 и лонафарниб са значително различни (фиг. 2E, F), което показва, че LNK -754 мишки, свързани с по-малко дистрофични неврити.
Повишени нива на LAMP1 бяха открити в хемимозъчни хомогенати на мишки, третирани или с LNK-754, или с лонафарниб (фиг. S5A, B), в съответствие с предишни проучвания, показващи, че лонафарниб и LNK-754 увеличават броя на автолизозомите и нива на лизозомни мембранни протеини и хидролази [8, 9]. В съгласие с резултатите от имуноблот анализ за LAMP1 (фиг. S5A, B), средният интензитет на флуоресценция на общото LAMP1 имунооцветяване е значително увеличен в мозъците на мишки, третирани с LNK-754 и лонафарниб, в сравнение с мишки, третирани с носител (фиг. , S5C, D).

За разлика от общото ниво на флуоресценция на LAMP1, средният интензитет на флуоресценция на LAMP1 в дистрофичните неврити е непроменен между носител, LNK-754 и мишки, третирани с лонафарниб (фиг. S5E, F). В кортекса на мишки, третирани с LNK-754, интензитетът на флуоресценция на LAMP1 при дистрофии и натоварването на плаките са силно корелирани, докато не е открита корелация между интензитета на LAMP1 при дистрофиите и натоварването на плаките при мишки, третирани с лонафарниб или носител (фиг. 2G, H), разкриващи връзка между натрупването на дистрофичен неврит LAMP1 и тежестта на плаките в LNK-754 мишки. В хипокампуса се наблюдава тенденция към корелация между интензитета на LAMP1 при дистрофии и тежестта на плаките. Заедно нашите резултати показват, че лечението с LNK-754 повишава общото ниво на LAMP1, но намалява патологичното натрупване на LAMP1 в дистрофични неврити, които обикновено присъстват в 5XFAD мишки.

Намалено натрупване на BACE1 в дистрофични неврити при LNK-754 хронично лекувани 5XFAD мишки

LAMP1 се намира върху мембрани на ендолизозомни органели, които са насочени към аксонален BACE1 към зрели лизозоми за разграждане. Следователно, FTI могат да инхибират генерирането на А и отлагането на извънклетъчни плаки чрез намаляване на образуването на аксонална дистрофия и натрупването на BACE1 около плаките. В подкрепа на тази хипотеза, нивото на дистрофичния неврит LAMP1 и тежестта на плаките са силно свързани в кортикалните области на мозъка при LNK-754 мишки.

Нашият анализ на имунооцветяването с LAMP1 разкри, че в сравнение с лечението с носител или лонафарниб, плаките в третирани с LNK-754 5XFAD мишки са свързани с по-малко дистрофични неврити (фиг. 2). За да определим дали нивото на BACE1 в дистрофичните неврити е понижено по подобен начин на плака, ние извършихме конфокална имунофлуоресцентна микроскопия на кортикални и хипокампални мозъчни тъкани на мишки, третирани с носител, LNK-754 и лонафарниб за BACE1, в допълнение към LAMP1 и A 42 (Фиг. 3A, B).

Тук покритата площ с BACE1 е значително намалена в кортикалните мозъчни региони на мишки, третирани с LNK-754, и се наблюдава тенденция при мишки, третирани с лонафарниб (фиг. 3C). Анализът на BACE1 покритата област в дистрофичните неврити в хипокампуса беше възпрепятстван от високото ниво на експресия на BACE1 в пресинаптичните терминали на пътя на CA3 хипокампалните мъхести влакна [17]. Допълнително анализирахме дали по-малко BACE1 се локализира в ендолизозоми в дистрофични неврити чрез измерване на корелационния коефициент на Pearson за BACE1 и LAMP1 при дистрофии. Значително намаление на ко-локализацията на BACE1 и LAMP1 на плака беше установено в кортикалните области на мозъка при мишки, третирани с LNK-754-, в сравнение с лечението с носител (фиг. 3D).

В хипокампуса е установено значително намаляване на ко-локализацията на BACE1 и LAMP1 на плака за LNK-754 в сравнение с лонафарниб и е наблюдавана тенденция към намаление при лечението с LNK-754 в сравнение с носител (фиг. 3E). Тези резултати са в съответствие с нашите констатации за натоварването на плаките и покритата с LAMP1 площ и допълнително подкрепят идеята, че лечението с LNK-754 намалява образуването на дистрофични неврити, намалявайки натрупването на увредени ендолизозомни органели, които са насочени към BACE1 за разграждане.

Острото лечение с LNK-754 намалява късното натрупване на ендозоми и лизозоми в дистрофични неврити в живи мозъчни срезове на 5XFAD мишки

След това тествахме острите ефекти на LNK-754 и лонафарниб върху дистрофични неврити чрез извършване на конфокално изобразяване на живи мозъчни тъкани. В този експеримент 5-месечни мишки 5XFAD бяха инжектирани ежедневно с носител, LNK-754 или лонафарниб в продължение на 3 седмици. Ние оцветихме тъкани с LysoTracker-Green (LT), сонда, която обикновено се използва за проследяване и селективно идентифициране на подкислени късни ендозоми и лизозоми в живи клетки [53]. Моделът на оцветяване с LT и тиазин червено е в съответствие с нашите резултати от имунооцветяване за дистрофични невритни маркери в 5XFAD мишки (Фиг. 2A, B; Фиг. 3A, B); LT-позитивните късни ендозоми и лизозоми са силно концентрирани в дистрофични неврити, тясно свързани с амилоидни плаки в живи мозъчни тъкани (фиг. 4А).

Острото 3-седмично лечение на 5-месечни 5XFAD мишки с LNK-754 или лонафарниб беше недостатъчно за намаляване на размера на плаката (фиг. 4B), въпреки че лечението с LNK-754 предизвика значително намаляване на съотношението на LT: TR на плака и размер на дистрофичен неврит (фиг. 4C, D). Интересно е, че за разлика от нашите открития за LAMP1 или BACE1, острото лечение с лонафарниб също намалява размера на дистрофията и съотношението LT: TR на плака (фиг. 4C, D). Размерът на дистрофичния неврит и размерът на плаките корелираха силно при третирани с LNK-754 5XFAD мишки (Фиг. 4F), а също така се наблюдава значителна корелация при мишки, третирани с лонафарниб (Фиг. 4G). Не съществува корелация при мишки, третирани с носител (фиг. 4E). Нашите резултати потвърждават, че LNK-754 намалява аксоналната дистрофия и предполагат, че FTI могат да намалят късното натрупване на ендозоми и лизозоми около плаки, дори след екстензивно отлагане на плака и дегенерация на аксон.

Подобряване на дефицитите в ученето и паметта при hAPP/PS1 мишки след краткотрайно лечение с LNK-754

LNK-754 предотвратява натрупването на LAMP1, BACE1 и LT в дистрофични неврити при 5XFAD мишки, което предполага, че лечението с LNK-754 предпазва от А-свързана синаптична дисфункция. За да оценим дали лечението с LNK-754 има благоприятен ефект върху когнитивната функция, ние оценихме краткосрочната ефикасност на пероралното лечение с LNK-754 върху пространственото обучение и паметта в hAPP/PS1 AD миши модел [40] . Пространствената памет на hAPP/PS1 мишки се подобрява след 12 дни перорално лечение с LNK-754, както е оценено от Morris Water Maze (MWM).

По време на обучителните сесии на скритата платформа, третирани с LNK-754 hAPP/PS1 мишки се научиха да намират платформата по-бързо от hAPP/PS1 мишки, третирани с носител, което доведе до крива на обучение, която е значително различна от тази на hAPP, третирани с носител /PS1 контролни мишки (фиг. 5А). Третираните с носител hAPP/PS1 мишки отнеха значително повече време, за да намерят платформата в сравнение с третираните с носител контроли от див тип на дни 4 и 7 от обучителните опити, докато не бяха открити значителни разлики между третираните с LNK-754 hAPP/ PS1 мишки и мишки от див тип, третирани с носител (фиг. 5A-C).

По време на пробния тест, LNK-754-третирани hAPP/PS1 животни показаха увеличено време, прекарано в целевия квадрант (фиг. 5D) и повишена честота на пресичане на платформа (фиг. 5E), сравнимо с третирани с носител животни от див тип . Нивата на A 42 бяха измерени чрез ELISA и бяха непроменени в разтворими и неразтворими мозъчни хомогенати от третирани с носител или LNK-754-третирани hAPP/PS1 мишки (фиг. 5F, G), което предполага, че подобрената памет и пространственото учене не са резултат от понижено амилоидно натоварване при третирани с LNK-754 hAPP/PS1 мишки.

For more information:1950477648nn@gmail.com