Приготвяне и прилагане на гликозид Cistanche чрез метод на ензимна хидролиза

Резюме: Проучване на получаването на гликозид Cistanche чрез ензимна хидролиза и изследване на приложението му. Използвайки степента на екстракция на Cistanche гликозид като индикатор за оценка, методът на ензимна хидролиза беше използван за извличане на Cistanche гликозид и беше определен с помощта на високоефективна течна хроматография (HPLC). Чрез конструирането на модел на стареене на мишка, гликозидите на Cistanche deserticola, получени чрез ензимна хидролиза, бяха приложени към стареещите моделни мишки и бяха наблюдавани способностите за учене и памет на стареещите моделни мишки, както и откриването на нивата на окисляване на мозъчната тъкан. Резултатите показват, че оптималните условия за ортогонален експеримент на ензимна хидролиза са: когато съотношението материал към течност е 1:10, времето за екстракция е 3 пъти, температурата на екстракция е 80 градуса, а времето за екстракция е 1 минута, степента на екстракция на гликозидите от Cistanche deserticola е най-висока. В сравнение с контролната група, ефектът на гликозида Cistanche върху стареещи моделни мишки значително подобрява техните способности за учене и памет (P<0.05); After treatment with cistanche glycoside, the content of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in brain tissue of aging model mice increased significantly (P<0.05), while the content of malondialdehyde (MDA) decreased significantly (P<0.05). In this study, the preparation method of Cistanche glycosides was optimized and the anti-aging ability of Cistanche glycosides was tested. This study laid a theoretical and practical foundation for the further development and clinical application of Cistanche glycosides in the future.  

Фенилетанол гликозидът е основният активен компонент на Cistanche deserticola

Ключови думи: метод на ензимна хидролиза; Cistanche гликозид; Стареещи моделни мишки; антиоксидант; приложни изследвания

1 Експериментална част

1.1 Основни материали, реактиви и инструменти

Здрави мъжки ICR мишки, Beijing Huizhi Heyuan Biotechnology Co., Ltd; Cistanche гликозид, Anyang Yishoutang Pharmaceutical Chain Co., Ltd; Стандартен гликозид Cistanche (чистота по-голяма или равна на 99.0 процента), Wuhan Huashun Biotechnology Co., Ltd; Inner Mongolia Beiqi, Shanxi Beiqi, Inner Mongolia Cistanche гликозид специален клас, Inner Mongolia Cistanche гликозид първи клас, Inner Mongolia Cistanche гликозид втори клас, Shanxi Heipi Qi AA клас, Shanxi Heipi Qi A клас, Gansu Cistanche гликозид, всички закупени от местни аптеки; Метанол, етанол, аналитичен алкохол, Nanjing Datang Chemical Co., Ltd; Комплекти SOD, MDA и CAT, Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.

DFY400 Въртяща се високоскоростна мелница за традиционна китайска медицина, Zhejiang Wenling Dade Traditional Chinese Medicine Machinery Co., Ltd; SHZ-D циркулационна водна вакуумна помпа, Gongyi Yuhua Instrument Co., Ltd; 101-1Y инфрачервена сушилня, Hangzhou Lantian Laboratory Instrument Factory; U2001 ултравиолетово-видим спектрофотометър, Hitachi, Япония; Aglient 1100 LC високоефективна течна хроматография, Agilent Technologies, САЩ; 6511 електрически миксери, Shanghai Specimen Model Factory; PHS-3C Acidity Meter, Shanghai Ridao Scientific Instrument Co., Ltd; DF-500 машина за сушене чрез замразяване, Baokun Vacuum Technology Co., Ltd.

Екстракт от цистанче на прах

Щракнете тук, за да видите продуктите на Cistanche

【Попитайте за повече】 Имейл:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2 Експериментални методи

1. 2. 1. Обработка и екстракция на проби от гликозид Cistanche

Като се използва степента на екстракция на гликозиди Cistanche като индекс за оценка, L9 (34) ортогонален експериментален дизайн беше използван за изследване. Конкретният дизайн на схемата е показан в таблица 1.

Раздел. 1 Таблица на факторното ниво

Претеглете точно 100,0 g проба от гликозид Cistanche, изсушете я в сушилня, натрошете я, прекарайте през сито с отвори 60 и извлечете гликозида Cistanche от самоензимен хидролизат на Scutellaria baicalensis съгласно ортогоналната експериментална схема в таблица 1 [13,14].

1. 2. 2. Определяне съдържанието на гликозид Cistanche

Използвайте UV-видим спектрофотометър, за да определите съдържанието на Cistanche гликозид. Измерете точно 0.5 mL екстракт от гликозид Cistanche и го смесете с 4,5 mL ултрачиста вода. Добавете 0.5 mL 5% разтвор на натриев нитрит и го оставете да престои 5 минути. След това добавете 0.5 mL от 10 процента разтвор на алуминиев нитрат. Внимателно разбъркайте и оставете да престои 6 минути. След това добавете 4 mL от 1,0 mol/L разтвор на натриев хидроксид. Внимателно разбъркайте и оставете да престои 15 минути. Измерете при дължина на вълната 510 nm между ултравиолетова и видима светлина.

Експеримент Cistanche deserticola

1. 2. 3 HPLC анализ

Използване на колона Kromasil C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) Стайна температура, инжекционен обем 20 μL. Скорост на потока 1 mL/min, A-фаза вода, B-фаза ацетонитрил. Процедура на елуиране: 0-5 минути, 5 процента фаза B, 95 процента фаза A; 5-8 минути, 5 процента -8 процента фаза B, 95 процента -92 процента фаза A; 8-15 минути, 20 процента фаза B, 80 процента фаза A; 15~18 минути, 20% ~30% фаза B, 80% ~70% фаза A; 18-35 минути, 30 процента -45 процента фаза B, 70 процента -55 процента фаза A; 35~38 минути, 45% ~80% фаза B, 55% ~20% фаза A. Дължината на вълната на откриване е 254 nm.

1. 2. 4 Групиране и администриране на животните

Бяха избрани 72 здрави мъжки ICR мишки и разделени на случаен принцип в 4 групи, с 18 мишки във всяка група: контролна група (Con група), моделна група (Mod група), положителна контролна група (PC група) и група на цистанхе гликозид (HQ група ). Контролната група мишки получи перорално приложение на двойно дестилирана вода и подкожно инжектиране на изотоничен физиологичен разтвор; Мишките в моделната група бяха перорално приложени с двойно дестилирана вода и подкожно инжектирани с 400 mg/kg D-neneneba галактоза; В положителната контролна група, 800 mg/kg пирацетам е приложен перорално и 400 mg/kg D-neneneba галактоза е инжектирана подкожно; На мишките в групата с цистанхе гликозид бяха дадени 400 mg/kg астрагалозид (дозата беше определена в предварителния експеримент; Shanxi Beiqi) перорално и 400 mg/kg D-neneneba галактоза беше инжектирана подкожно. Всички експериментални мишки бяха приложени орално и подкожно в продължение на 10 последователни седмици. Претегляйте всяка мишка всяка седмица и наблюдавайте внимателно физическото състояние на всяка група мишки. През 9-та седмица, след перорално приложение и подкожна инжекция за 30 минути, всяка група мишки беше подложена на тестове за скачане на платформа и избягване на тъмнината. През 10-та седмица тестът с воден лабиринт на Морис беше извършен върху всяка група мишки. През 11-та седмица мозъчната тъкан на всяка група мишки беше взета, за да се определи съдържанието на супероксид дисмутаза (SOD), каталаза (CAT) и малондиалдехид (MDA) в мозъчната тъкан.

1. 2. 5 Измерване на способността за учене и памет при стареещи мишки

1) Експеримент за избягване

Преди експеримента мишките бяха поставени върху инструмента и аклиматизирани за 3 минути. След пълно адаптиране към тъмния инструмент и среда, мишките бяха поставени обратно в клетката за размножаване. След това мишките бяха подложени на продължителен електрически удар, докато стояха на пода. След настъпилия шок мишките инстинктивно избягали от пода към платформата, а целият тренировъчен процес продължил 5 минути. След като експериментът приключи, общият брой пъти, когато мишките са получили електрически удари, беше преброен, което е броят на грешките при избягване на тъмнината.

Пустинна жива цистанче

2) Експеримент с платформа за скачане

Експерименталното устройство с платформа за скачане е 45 cm × 35 cm × 25 cm органична стъклена кутия с вътрешна преграда и гумена подложка с диаметър 9,5 cm и височина 4,5 cm е поставена от лявата страна на лявата и дясната страна решетки. Дъното на кутията е покрито с медни решетки като електроди за стимулиране. Когато бъде подложена на стимулация с електрически удар, мишката ще избяга на безопасна платформа и след това ще скочи от платформата. Когато краката на мишката влязат в контакт с електрическата мрежа и получат токов удар, това е реакция на грешка. Запишете броя на грешките и латентността на мишката в рамките на 3 минути. След 24 часа тестът отново измерва способностите за учене и памет на мишките въз основа на броя на грешките и латентността.

3) Експеримент с воден лабиринт

Преди експеримента мишките бяха поставени в устройство с воден лабиринт и бяха оставени да плуват свободно в продължение на 2 минути, за да се адаптират към околната среда.

Експеримент с навигация за позициониране [15]: Запишете времето, когато мишките намерят платформата.

Експеримент за изследване на космоса [16]: запишете времето на мишките, пресичащи платформата.

1. 2. 6 Определяне на съдържанието на антиоксиданти в мозъчната тъкан на 6 стареещи мишки

След отделяне на мозъчната тъкан на мишка съгласно конвенционалните методи, съдържанието на SOD, MDA и CAT в мозъчната тъкан на всяка група мишки беше измерено съгласно етапите на работа на комплекти SOD, MDA и CAT.

1.3 Статистика и анализ на данни

В това проучване всички данни бяха статистически анализирани с помощта на електронни таблици на Excel и софтуер SPSS19.0, а разликите между групите бяха оценени с помощта на сдвоени t-тестове. Когато П<0.05, it indicates statistical significance; When P<0.01, it indicates significant statistical significance.

2 Резултати и дискусия

2.1 Ортогонален експеримент

Таблица 2 показва резултатите от ортогоналния експеримент за Cistanche гликозиди. Може да се види от таблица 2, че оптималният процес на екстракция е A3B1C2D3, с температура на екстракция 80 градуса, време на екстракция 1 минута, съотношение твърдо вещество-течност 1:10 и три пъти на екстракция. Постига се най-висока степен на екстракция на гликозидите Cistanche.

Раздел. 2 Ортогонален експеримент на гликозид Cistanche

2.2 Определяне на съдържанието на гликозид Cistanche

UV видимата спектрофотометрия беше използвана за откриване на екстракт от 8 проби от цистанхе гликозид. Резултатите са показани на фигура 1 и има значителни разлики в съдържанието на гликозид цистанхе между различните региони или разновидности. Сред тях Shanxi Beiqi има най-високо съдържание на гликозид цистанхе, докато Shanxi Heipi Qi има най-ниското съдържание на гликозид цистанхе от клас АА.

Фиг. 1 Определяне на различни видове Cistanche гликозид

2.3 HPLC откриване на Cistanche гликозиди

Съгласно хроматографските условия, определени в раздел 1.2.3, HPLC диаграмата на Cistanche гликозидите е показана на Фигура 2. Времето на задържане на Cistanche гликозидите е 10.64 минути, а масовата концентрация е 1.{{ 7}}.0 μ G/mL, с добра линейност и R-стойност 0.999 8.

Фиг. 2 HPLC диаграма на Cistanche гликозид

2.4 Прецизност и стабилност

Вземете същата партида от тестовия разтвор на гликозид Cistanche и инжектирайте 6 последователни пъти, за да определите площта на пика на гликозида Cistanche. Резултатите показват, че прецизността RSD на гликозидите на Cistanche е по-малка от 2,5 процента (n=6), което показва добра прецизност на гликозидите на Cistanche.

Вземете същата партида от тестовия разтвор на гликозид Cistanche и измерете площта на пика на гликозида Cistanche съответно на {{0}}, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 часа. Резултатите показват, че RSD на стабилността на гликозида Cistanche е по-малко от 2,0 процента (n=6), което показва, че гликозидът Cistanche има добра стабилност в рамките на 24 часа.

2. 5 Ефект на гликозида Cistanche върху телесното тегло на стареещи моделни мишки

Справка [17-19] установи, че дозировката на Cistanche гликозиди, използвани в това проучване, не предизвиква системна токсичност при мишки. Както е показано на фигура 3, теглото на всички групи мишки се увеличава преди 6-та седмица. В сравнение с контролната група, теглото на мишките от моделната група намалява значително през същия период (P<0.01), while the weight of the positive control group and astragalus group mice slightly decreased. After the 6th week, the weight of the control group mice continued to increase, while the weight of the model group mice no longer increased. The positive control group and the Cistanche glycoside group slightly increased.

Фиг. 3 Ефектът на гликозида Cistanche върху телесното тегло на стареещите моделни мишки

2.6 Резултати от поведенческия експеримент

2. 6. Наблюдение на ефекта на Cistanche Cistanche Glycoside върху стареещи моделни мишки чрез експеримент за избягване на тъмнината

Както е показано на Фигура 4А, периодът на латентност на мишките във всяка група беше удължен на втория ден в сравнение с първия ден. В сравнение с контролната група, времето на латентност на мишките от моделната група е значително намалено (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of mice in the positive control group and the Cistanche glycoside group was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

2. 6. Наблюдение на ефекта на Cistanche Cistanche Glycoside върху стареещи моделни мишки чрез двуетапен платформен експеримент

Както е показано на фигура 5, времето на латентност на платформата за скачане във всяка група мишки беше удължено на втория ден в сравнение с първия ден. В сравнение с контролната група, времето на етапа на скачане на мишките от моделната група е значително намалено (P<0.05); Compared with the model group, the latency time of the jumping platform in the positive control group and the Cistanche glycoside group of mice was significantly increased (P<0.05). As shown in Figure 4B, the number of errors in each group of mice decreased on the second day compared to the first day. Compared with the control group, the number of errors in the model group mice significantly increased (P<0.05); Compared with the model group, the positive control group and the Cistanche glycoside group significantly reduced the number of errors in mice (P<0.05).

В сравнение с контролната група, P<0.05; Compared with the control group, P<0.01; Compared with the model group, the '#' is P<0.05; Compared with the model group, P<0.01, the same below

Фиг. 4 Експерименти за избягване на тъмнината за наблюдение на ефекта на гликозида Cistanche върху стареещите моделни мишки. Време на латентност （A）; Брой грешки （B）

Фигура 5. Ефектът на гликозида Cistanche върху мишки модел на стареене, наблюдаван чрез експеримент със скачане на платформа. Време на латентност （A）; Брой грешки

2. 6. 3 Експеримент с воден лабиринт на Морис за наблюдение на ефекта на гликозидите на Cistanche върху стареещи моделни мишки

Както е показано на Фигура 6, с увеличаване на броя на дните на обучение, времето за всяка група мишки да намери платформата постепенно намалява. В сравнение с контролната група, времето за мишките от моделната група да намерят платформата значително се увеличи (P<0.05), while the time for the positive control group and the Cistanche glycoside group mice to find the platform slightly increased.

В сравнение с контролната група, P<0.05

Фиг. 6 Ефектът на гликозида Cistanche върху мишките модел на стареене, наблюдавани чрез експеримент за позициониране

Както е показано на фигура 7, с увеличаването на броя на дните на обучение, броят пъти, когато всяка група мишки пресича платформата, постепенно се увеличава. В сравнение с контролната група, броят пъти, когато мишките от групата на модела пресичат платформата, значително намалява (P<0.05), while the number of times the positive control group and the Cistanche glycoside group mice crossed the platform slightly decreased.

Фиг. 7 Ефектът на гликозида Cistanche върху мишки модел на стареене, наблюдаван чрез експеримент за изследване на космоса

2. 7 Ефект на гликозидите Cistanche върху нивата на антиоксиданти в мозъчната тъкан на стареещи моделни мишки

Както е показано на фигура 8, в сравнение с контролната група, ензимните активности на SOD и CAT в мозъчната тъкан на мишките от моделната група са значително намалени (P<0.05). The SOD and CAT enzyme activities in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice were slightly increased, while the MDA content in the brain tissue of the model group mice was significantly increased (P<0.05). The MDA content in the brain tissue of the positive control group and the Cistanche glycoside group mice was slightly reduced.

Китайска билка цистанче

3 Заключение

Това проучване използва степента на екстракция на гликозида Cistanche като индикатор за оценка и екстрахира гликозида Cistanche с помощта на метода на ензимна хидролиза. Съдържанието на Cistanche гликозид се определя чрез HPLC. Бяха направени следните заключения:

1) Когато съотношението на материал към течност е 1:1{{10}}, честотата на екстракция е 3 пъти, температурата на екстракция е 80 градуса, а реагентът за екстракция е 1 минута , степента на екстракция на гликозидите Cistanche е най-висока. Съдържанието на цистанхе гликозид в 8 различни разновидности се определя с помощта на UV видим спектрофотометър. Резултатите показват значителни разлики в съдържанието на гликозид от цистанхе между различните региони или разновидности. Сред тях Shanxi Beiqi има най-високо съдържание на цистанхе гликозид, докато Shanxi Heipi Qi има най-ниско съдържание на цистанх гликозид в клас AA. С цел по-нататъшно установяване на система за разделяне и пречистване на Cistanche гликозид, чрез HPLC беше установен пръстов отпечатък на Cistanche гликозид. Резултатите показват, че времето на задържане на гликозида Cistanche е 10,64 минути, масовата концентрация е 1,0~40,0 μG/mL, с добра линейност и R-стойност 0.999 8, а HPLC методът има добра стабилност и прецизност.

2) Ефект на гликозид Cistanche deserticola, получен чрез ензимна хидролиза върху стареещи моделни мишки, наблюдаване на способностите за учене и памет на възрастови моделни мишки и откриване на нивата на окисляване на мозъчната тъкан. Резултатите показват, че в сравнение с контролната група, гликозидите Cistanche значително подобряват способностите за учене и памет на мишки с възрастов модел след лечение (P<0.05); Compared with the control group, the activity of SOD and CAT enzymes in the brain tissue of aging model mice significantly increased (P<0.05) after treatment with Cistanche glycosides, while the content of MDA significantly decreased (P<0.05).

справка:

［1 ］ Уанг Сяодзю. Екстракция, разделяне и изследване на активността на активните компоненти на Cistanche гликозид ［D］. Сиан: Университет Шанси, 2005 г.

［ 2 ］ Wang Guangzhong, Hu Di, Chen Jingbing. Ортогонален дизайн за оптимизиране на процеса на екстракция на общите флавоноиди и общите сапонини на Cistanche гликозид ［J］. Китайска патентна медицина, 2004, 26（10）: 3-4.

［ 3 ］ Liu Jinhua, Chen Jingran, You Guangfu. Напредък във фармакологичните изследвания върху миокардната защита на Astragalus ［J］. Китайска патентна медицина, 2002, 24(8）: 623-626.

［ 4 ］ Гуо Вей. Фармакология и преглед на клиничните изследвания на традиционната китайска медицина Cistanche гликозид ［J］. Шанси Традиционна китайска медицина, 2011, 27(11）: 52-54.

［ 5 ］ Lu Yanqi, He Xueli. Преглед на химическите съставки и фармакологичните ефекти на Cistanche гликозид ［J］. Journal of Baoding Teachers College, 2004, 17（4）: 40-42.

［ 6 ］ Li Qin, Liu Hong. Фармакологични ефекти и клинично приложение на Cistanche гликозид ［J］. Китайска медицина на традиционната китайска медицина, 2004, 10（10）: 633-635.

［7 ］ Джин Джизи. Напредък в изследванията върху фармакологичните ефекти и клиничното приложение на Cistanche гликозид ［J］. Китайска медицина на традиционната китайска медицина, 2008, 17(20）: 134-135. ［ 8 ］ Chen Jianzhen, Lv Guiyuan, Ye Lei. Напредък в изследванията върху химическите съставки и фармакологичните ефекти на Cistanche гликозид флавоноиди ［J］. Medical Herald, 2009, 28（10）: 1314-1316.

［ 9 ］ Liang Liansheng, Yu Jing. Фармакологични ефекти на флавоноидите в Cistanche гликозид ［J］. Вестник за интегративна китайска и западна медицина, сърдечно-съдови и мозъчно-съдови заболявания, 2005, 3（12）: 1085-1087.

［10］ Zhang Dongqing, Wang Deqing. Напредък в изследванията върху биологичната активност на общите флавоноиди на Cistanche гликозид ［J］. China Important Journal, 2010, 35(2）: 253-256.

［11］ Li Y, Guo S, Zhu Y, Yan H, et al. Цветовете на Cistanche glycoside membranaceus var. mongholicus като нов продукт с висок потенциал: фитохимична характеристика и антиоксидантна активност ［J］. Молекули, 2019, 24 (3): 434.

［12］ Butkutė B, Dagilytė A, Benetis R, et al. Минерални и фитохимични профили и антиоксидантна активност на билков материал от два умерени гликозидни вида Cistanche ［J］. Biomed. Рез. Междун., 2018 г.

［13］ Sharifi-Rad M, Pohl P, Epifano F, et al. Зелен синтез на сребърни наночастици с помощта на Cistanche glycoside tribuloides delile. Екстракт от корен: характеристика, антиоксидантни, антибактериални и противовъзпалителни действия ［J］. Наноматериали （Базел）, 2020 г., 10（12）: 2383.

［14］ Wang D, Zhuang Y, Tian Y, et al. Изследване на ефектите на общите флавоноиди на гликозида Cistanche върху образуването на атеросклероза и потенциалните механизми ［J］. Оксид. Med. клетка. Лонгов., 2012.