Тъканно-специфична експресия на SARS-CoV-2 рецептора, ангиотензин-конвертиращ ензим 2, в миши модели на хронично бъбречно заболяване
Mar 22, 2022
От януари 2020 г. коронавирусната болест 2019 (COVID-19), причинена от тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), е глобален проблем за общественото здраве. SARS-CoV-2 инфекция се установява, когато вирусният S протеин се свърже с гостоприемника ангиотензин-конвертиращ ензим 2 (ACE2) и навлезе в клетката1,2. Следователно, повишената експресия на ACE2 в органи, които са потенциални мишени на SARS-CoV-2, може да увеличи риска от инфекция с COVID- 19. ACE2 е ензим, който играе важна роля в системата ренин-ангиотензин (RAS), където превръща ангиотензин (Ang) II в Ang1-7 и образува компонент на ACE2-Ang{{21 }}MAS рецепторна ос3. Той също така упражнява органозащитен ефект, като противодейства на активността на ACE-Ang II-ангиотензин тип 1 (AT1) рецепторна ос4-7. Предишни доклади показват, че ACE2 променя своите тъканно-специфични модели на експресия при различни състояния, включително сърдечно-съдови заболявания, захарен диабет (DM) ибъбречни заболявания 8–11. Белодробната експресия на ACE2, която е особено важна за SARS-CoV-2 инфекция, е намалена при индуциран от липополизахарид остър респираторен дистрес синдром12. Друг доклад показва, че експресията на ACE2 е по-висока при по-възрастните мъже13. В Катедрата по медицински науки и кардиоренална медицина, Висше училище по медицина към Yokohama City University, 3‑9 Fukuura, Kanazawa‑ku, Yokohama 236‑0004, Япония. 2 Програма за сърдечно-съдови и метаболитни нарушения, Медицинско училище Duke-NUS, Сингапур, Сингапур. 3 Департамент по медицина, планината Синай Бет Израел, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ. 4 Катедра по молекулярна биология, Медицински факултет на Yokohama City University, Йокохама, Япония. 5 Катедра по оториноларингология, хирургия на главата и шията, Факултет по медицина, Yokohama City University, Йокохама, Япония. 6 Вътрешна медицина, Стоматологичен университет Канагава.
Ключови думи;заболяване на бъбреците; бъбреци; бъбречен ACE2; бъбречни тъкани; бъбречна недостатъчност
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНО/БЪБРЕЧНО ЗАБОЛЯВАНЕ
Освен това, назалната и бранхиална експресия на АСЕ2 е по-висока при възрастни, отколкото при деца14. Въпреки това, доколкото ни е известно, малко проучвания са изследвали как белодробната експресия на ACE2 се променя при други заболявания. Пациенти с хроничнизаболяване на бъбреците(CKD) имат риск от тежко заболяване на COVID-19, но няма доказателства за повишено разпространение на COVID-19 при пациенти с ХБН15–21. Като се има предвид фактът, че АСЕ2 е необходим за инфекция с COVID-19, тези открития може да предполагат, че белодробната експресия на АСЕ2 не е повишена при пациенти с ХБН. По-специално, клетъчната експресия на ACE2 вероятно е свързана с податливостта към риска от инфекция от SARS-CoV, което е свързано със SARS-CoV-222. Фактът, че децата с ниска експресия на ACE2 са по-малко податливи на COVID-19 от възрастните23, също подкрепя тези хипотези. Следователно, ние проведохме експерименти, за да изследваме промените в белодробната експресия на ACE2 в два типа мишки модел на CKD: индуцирани от аденин (т.е. аденинови мишки) и индуцирани от аристолохинова киселина (АА) (т.е. AA мишки), за да отговорим на тази хипотеза. Връзката на експресията на ACE2 с блокерите на RAS също е изследвана. Досега е доказано, че употребата на RAS блокери повишава експресията на АСЕ2 в органа в някои случаи 24-27. Скорошни епидемиологични проучвания показват, че употребата на RAS блокери не повишава риска от COVID-1928–30. Освен това, експресията на ACE2 в белите дробове не се засилва, когато RAS блокери се прилагат на нормални мишки31. Въпреки това, няма доклади относно ефектите на RAS блокерите върху белодробната експресия на ACE2 в контекста на ХБН; тази точка е от съществено значение за бъдещото управление на COVID-19 и неговите последствия. Тук изследвахме промените в белодробната експресия на ACE2, дължащи се на лечение с RAS блокер при мишки модел на CKD.
РезултатиИндуцираните от аденин мишки с модел на CKD показват значителна загуба на тегло, влошаване на бъбречната функция и повишено кръвно налягане (BP) в сравнение с контролите. Изходното телесно тегло (BW) и систолното BP са идентични между контролната и адениновата група. BW нараства с времето в контролната група, докато намалява в групата на аденин; това увеличение на BW е значително различно между групите (фиг. 1A). Систолното BP е значително повишено в групата на аденин, в сравнение с контролната група, с течение на времето (фиг. 1B). На 2 седмици екскрецията на албумин в урината е значително повишена в групата на аденин в сравнение с контролната група (мишки с аденин 41.0±8,3 ug/ден спрямо контрола 13,6±1,7 ug/ден, P<0.001; fig. 1e).="" there="" were="" also="" signifcant="" enhancements="" of="" plasma="" creatinine="" and="" blood="" urea="" nitrogen="" (bun)="" levels="" in="" the="" adenine="" group,="" compared="" with="" the="" control="" group="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (creatinine:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 0.22±0.01 mg/dl="" vs.="" control="" 0.10±0.01 mg/="" dl,=""><0.05; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.31±0.06 mg/dl="" vs.="" control="" 0.11±0.01 mg/dl,=""><0.01; bun:="" 2 weeks:="" adenine="" mice="" 65.0±7.0 mg/dl="" vs.="" control="" 25.7±0.5 mg/dl,=""><0.01; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 61.7±12.5 mg/dl="" vs.="" control="" 25.6±1.6 mg/dl,=""><0.01; fig. 1c,="" d).="" moreover,="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" adenine="" group="" (2 weeks:="" adenine="" mice="" 170±15 μl/min="" vs.="" control="" 397±25 μl/min,=""><0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 136±29 μl/min="" vs.="" control="" 357±31 μl/min,=""><0.001;>
Експресията на ACE2 в бъбреците е значително намалена при индуцирани от аденин мишки модел на CKD в сравнение с контролите, докато експресията на ACE2 в белите дробове не се различава между групите.Бъбречната хистология показва хетерогенно разширение и атрофия на тубулите, както и клетъчна инфилтрация вбъбречнаинтерстициум, в аденинови мишки. Оцветяването с ACE2 се наблюдава главно в проксималните тубули и в двете групи, но степента на оцветяване е намалена в групата с аденин (фиг. 2А). Нивата на протеин ACE2 вбъбреци(изчислено чрез Western blotting анализ) показва значително намаление в групата на аденин в сравнение с контролната група както на 2, така и на 4 седмици (2 седмици: мишки с аденин 0.55±0.{{ 9}}4 срещу контрола 1.00±0,10, P<0.001; 4 weeks:="" adenine="" mice="" 0.32±0.07="" vs.="" control="" 0.90±0.07,=""><0.001; fig. 2c).="" in="">бъбречен АСЕ2Експресията на иРНК показва значително намаление в групата на аденин на 2 седмици (мишки с аденин 0.61±0.04 спрямо контрола 1.00±0.03, P<0.001; fig. 2e);="" a="" similar="" tendency="" for="" reduction="" was="" observed="" at="" 4 weeks,="" although="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" signifcant="" (fig. 2e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="" groups;="" ace2="" staining="" was="" observed="" in="" type="" 2="" alveolar="" epithelial="" cells="" (fig. 2b).="" there="" were="" no="" differences="" in="" ace2="" protein="" or="" mrna="" expression="" levels="" in="" the="" lungs="" at="" 2="" or="" 4 weeks="" (fig. 2d,="" f).="" the="" difference="" in="" plasma="" ace2="" activity="" was="" not="" statistically="" signifcant="">
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА НЕДОСТАТЪЧНОСТ
АА-индуцираните моделни мишки на CKD показаха значителна загуба на тегло и влошаване на бъбречната функция в сравнение с групата на носителя, докато BP не се различава между групите.Изходната BW и систолното BP са идентични между групите с носител и AA. BW нараства с течение на времето в групата на носителя, докато намалява в групата на AA; това увеличение на BW е значително различно между групите (фиг. 3A). Въпреки това, няма разлика в систоличното АН между групите (фиг. 3B). В сравнение с групата на носителя, има значително подобрение на плазмения креатинин и нивата на BUN, както и на екскрецията на албумин в урината, в групата на AA (креатинин: AA мишки 0.40±{{6} }.03 mg/dL спрямо носител 0,14±0,01 mg/dL, P<0.001; bun:="" aa="" mice="" 62.8±4.6 mg/="" dl="" vs.="" vehicle="" 29.0±1.4 ="" mg/dl,=""><0.001; urinary="" albumin="" excretion:="" aa="" mice="" 61.3±7.3 ="" μg/day="" vs.="" vehicle="" 9.5±0.9 μg/day,=""><0.001; fig. 3c–e).="" creatinine="" clearance="" also="" showed="" a="" signifcant="" reduction="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 72±12="" μl/min="" vs.="" vehicle="" 159±13="" μl/min,=""><0.001;>
Експресията на ACE2 в бъбреците е значително намалена при мишки модел на AA-индуцирана CKD в сравнение с контролите, докато белодробните нива на ACE2 протеин не се различават между групите. Хистологичният анализ на бъбреците показва тубулна атрофия и клетъчна инфилтрация вбъбречнаинтерстициум в групата на АА. ACE2 оцветяване се наблюдава главно в проксималните тубули и в двете групи, но степента на оцветяване е намалена в АА групата (фиг. 4А). Нивата на протеин ACE2 вбъбреципоказаха значително намаление в групата на АА в сравнение с групата на носител (АА мишки {{0}}.22±0.03 спрямо носител 1.00±0.08, P<0.001; fig. 4c).="" in="" addition,="">бъбречен АСЕ2Експресията на иРНК беше значително намалена в АА групата (АА мишки {{0}}.30±0,02 спрямо носител 1.00±0,06, P<0.001; fig. 4e).="" lung="" histology="" findings="" did="" not="" differ="" between="">
Оцветяване с ACE2 се наблюдава в алвеоларни епителни клетки тип 2 (Фигура 4B) и няма разлика в нивото на белодробния ACE2 протеин между групите (Фигура 4D). Експресията на ACE2 иРНК в белите дробове е значително по-ниска в групата на AA, отколкото в групата на носител (AA мишки 0.76±0.04 срещу носител 1.{{11} }±0,04, P<0.01; fig. 4f).="" moreover,="" there="" was="" a="" signifcant="" reduction="" in="" plasma="" ace2="" activity="" in="" the="" aa="" group="" (aa="" mice="" 84.8±2.6="" rfu/min="" vs.="" vehicle="" 98.3±3.0="" rfu/min,=""><0.01;>
Олмесартан отслабва повишаването на BP и екскрецията на албумин в урината и намаляване на загубата на тегло при индуцирани от аденин мишки модел на CKD.Лечението с олмесартан отслабва загубата на тегло при аденинови мишки (фиг. 5А). Лечението с олмесартан също значително намалява систоличното АН както в контролната група, така и в групата с аденин (мишки с аденин 131,5±0.4 mmHg срещу контрола 121,2±0.7 mmHg, P<0.001; olmesartan="" mice="" 111.7±1.1 ="" mmhg="" vs.="" control="" 121.2±0.7 ="" mmhg,=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 117.2±0.9 ="" mmhg="" vs.="" adenine="" mice="" 131.5±0.4 mmhg,=""><0.001; fig. 5b).="" in="" adenine="" mice,="" olmesartan="" treatment="" improved="" plasma="" creatinine="" level="" (adenine="" mice="" 0.19±0.02="" vs.="" control="" 0.13±0.01,="" p="" <="" 0.01;="" adenine+olmesartan="" mice="" 0.14±0.01="" vs.="" adenine="" mice="" 0.19±0.02,="" p="" <="" 0.01;="" fig. 5c)="" and="" suppressed="" urinary="" albumin="" excretion="" (adenine="" mice="" 67.9="" ±6.7 μg/day="" vs.="" control="" 18.0±3.6 μg/day,="" p=""><0.001; adenine+olmesartan="" mice="" 52.5±2.3="" vs.="" olmesartan="" mice="" 17.4±3.7 μg/day,=""><0.001; adenine-olmesartan="" mice="" 52.5±2.3 μg/day="" vs.="" adenine="" mice="" 67.9±6.7 μg/day,=""><0.05;>
Олмесартан не повлиява експресията на ACE2.В контролната група и групата с аденин, нивата на експресия на mRNA или протеин на ACE2 в бъбреците не се променят от лечението с олмесартан (фиг. 6A, C). Няма промени в белодробната ACE2 иРНК или нивата на експресия на протеин между контролната и адениновата група (фиг. 6B, D). Също така няма значителна разлика в плазмената ACE2 активност (фиг. 6E). Експресията на ACE2 mRNA в горните дихателни пътища (фаринкса) също беше изследвана, но не беше наблюдавана значителна разлика между групите (допълнителна фигура S1).
ДискусияПандемията от COVID-19 оказа дълбоко въздействие в целия свят. За възрастни хора и хора със съпътстващи заболявания информацията относно риска от инфекция и тежестта на COVID-19 е критично съображение. Има множество епидемиологични проучвания на COVID-19 в световен мащаб, които показват, че пациентите с ХБН са по-склонни да развият тежка форма на COVID-1917, но заболеваемостта от COVID-19 може да не е повишена при пациентите с CKD15–21. Трябва да се отбележи, че резултатите от няколко мета-анализа разкриха, че разпространението на ХБН е 1,7–5,2 процента при пациенти с COVID-1915–17,21. В допълнение, анализ на 5700 пациенти с COVID-19 в Нов
Районът на Йорк показа, че 8,5 процента са имали основнибъбречно заболяване 19. Като се има предвид, че изчисленото разпространение на ХБН е 9,1 процента в световен мащаб18 и приблизително 15 процента в Съединените щати20, рискът от инфекция със SARS-CoV-2 може да не се увеличи във връзка с наличието на ХБН. ACE2 играе важна роля в предаването на COVID-191,2. В допълнение, нивото на експресия на ACE2 в клетките на дихателните пътища е свързано с риска от инфекция от SARS-CoV, коронавирус, подобен на причинителя на COVID-1922. Тъй като COVID-19 е респираторно заболяване, експресията на ACE2 в белите дробове е важен компонент на предаването на болестта. В настоящото проучване предположихме, че липсата на повишаване на белодробната експресия на ACE2 при ХБН е свързана с липсата на повишена заболеваемост от COVID-19. Тази хипотеза се подкрепя от факта, че децата с ниска експресия на ACE2 са по-малко податливи на COVID-19 от възрастните. Използвахме два типа мишки модел на CKD в нашите експерименти, за да изследваме промените в белодробната експресия на ACE2 във връзка с патогенезата на CKD. Индуцираната от аденин ХБН е представителен животински модел на заболяване32. Прекомерното прилагане на аденин може да предизвика ХБН чрез причиняванебъбречнатубулна обструкция и дегенерация, както ибъбречнаинтерстициална фиброза, дължаща се на отлагането на 2-8 дихидроксиаденин32,33. Обратно, индуцираната от АА ХБН се причинява от индуциране на фиброза от индуцирано от АА тубулно увреждане34. Тези два модела са избрани, тъй като е доказано, че BP се повишава в модела на ХБН, индуциран от аденин35, докато не се увеличава в модела на ХБН, индуциран от АА36. Трябва да се отбележи, че хипертонията е често срещано усложнение, наблюдавано при пациенти с ХБН; ние предположихме, че би било полезно да се изследва дали наличието или отсъствието на хипертония влияе върху белодробната експресия на АСЕ2 в патогенезата на ХБН. Резултатите показаха, чебъбречен АСЕ2нивата на протеин са намалени и в двата модела на ХБН. При мишки с аденин нямаше значителна разлика в нивата на иРНК на 4 седмици, но имаше понижение в нивата на протеина. Една от причините за това несъответствие може да е участието на транслационна репресия. Lambert DW, et al. показа, че miR-421 потиска транслацията на ACE2 протеин, без да повлиява нивата на ACE2 транскрипт37. Друго проучване също показа, че серумният miR-421 е повишен при пациенти с ХБН или хипертония38,39. Така, в групата на мишки с аденин с по-дълъг период на ХБН и хипертония (4 седмици), miR-421
може да се увеличи и потисне транслацията на протеин, което води до несъответствие между иРНК и експресията на протеин. Нивата на белодробния ACE2 протеин не се различават и в двата модела на CKD в сравнение с контролите и носителите. Въпреки че е интригуващо, че експресията на белодробна АСЕ2 иРНК е намалена в модела на ХБН, предизвикан от АА, нашите открития са по-забележителни, защото не открихме разлика в нивата на белодробния АСЕ2 протеин, които пряко влияят на SARS-CoV-2 инфекцията. В допълнение, плазмената ACE2 активност не се различава и в двата модела на CKD в сравнение с контролите и носителите. Разтворимият ACE2 в плазмата се счита за разцепен и освободен от тъканните клетки. Съобщава се, че повишената плазмена ACE2 активност е свързана с увеличаване на освобождаването на ACE2 протеин от тъканите, което предполага намаляване на ACE2 протеина в тъканите40. По този начин, резултатите от настоящото проучване, че плазмената активност на ACE2 не е променена в състояние на CKD, показват, че освобождаването на протеин ACE2, експресиран в тъканите, не се променя в състояние на CKD, което подкрепя констатациите, че експресията на ACE2 протеин в тъканите е непроменена в контекста на ХБН. Връзката между COVID-19 и блокерите на RAS е постоянен фокус на изследователски дискусии. Предишни проучвания върху животни показаха, че RAS блокерите повишават тъканната експресия на ACE2, което доведе до опасения, че употребата на RAS блокери може да увеличи риска от инфекция със SARS-CoV-2. Въпреки това, използването на RAS блокери в тези предишни проучвания е довело само до повишаване на регулацията на тъканния ACE2 при специфични патологични състояния 24, 27; тази регулация не надхвърля нормалния диапазон. Друго проучване, изследващо белодробни ибъбречен АСЕ2експресията при нормални мишки, третирани с RAS блокери, не показва увеличение в сравнение с контролната група31. От друга страна, има доклад, че RAS блокерите като кандесартан и каптоприл повишават белодробната експресия на АСЕ2 при нормални плъхове41. В клиничната практика в реалния свят някои епидемиологични проучвания относно употребата на RAS блокери при пациенти с COVID-19 показват, че употребата на тези лекарства не повишава риска от COVID-1928–30. Въпреки това, ефектът на RAS блокерите върху белодробната експресия на ACE2 все още е спорен. Никакви предишни проучвания не са изследвали ефектите на RAS блокерите върху белодробната експресия на ACE2 в контекста на CKD, въпреки че RAS блокерите са от съществено значение за лечението на пациенти с CKD. Настоящото проучване беше проведено, за да се преодолее тази празнина в литературата. За да моделираме по-тясно клиничната практика в реалния свят, ние използвахме модела на аденин-индуцираната ХБН, който показва едновременна хипертония. Резултатите показват, че приложението на олмесартан, блокер на RAS, не повишава белодробната експресия на ACE2 в сравнение с контролите. В допълнение, експресията на ACE2 иРНК в горните дихателни пътища, първоначалната цел на SARS-CoV-2 инфекцията, не е повишена в отговор на лечението с олмесартан.Ренален ACE2протеиновите нива са намалени в модела на CKD; прилагането на олмесартан не повишава нивата на бъбречния АСЕ2 протеин при контролните мишки и мишките с аденин. Липсата на възстановяване на бъбречния АСЕ2 при аденинови мишки, третирани с олмесартан, може да се дължи на използването на различен модел на CKD, в сравнение с предишно проучване27, както и на относително кратката продължителност на лечението с ангиотензин рецепторен блокер25,27. Въпреки това, лечението с олмесартан подобрява няколко параметри на бъбречна недостатъчност, включително екскрецията на албумин в урината. Тези резултати подкрепят продължаването на употребата на RAS блокери при пациенти с COVID-19, които имат ХБН.
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНА/БЪБРЕЧНА ИНФЕКЦИЯ
Това проучване имаше някои ограничения. Първо, той изследва само промените в белодробната експресия на ACE2 при мишки модел на CKD, докато не изследва директно SARS-CoV-2 инфекция. Второ, наблюдавахме адениновите мишки в продължение на 4 седмици и AA мишките в продължение на 8 седмици в това изследване, но резултатите може да са различни при по-дълъг период на наблюдение. Трето, експресията на ACE2 в белите дробове може да се различава между мишки и хора. Четвърто, при пациенти с ХБН тежестта на COVID-19 вероятно ще бъде по-голяма, но не можем да се позовем на основния механизъм на тежестта. Пето, не само нивото на експресия на белодробния ACE2 определя чувствителността към COVID-19, но може да бъде повлияно и от много други фактори. В заключение, ние не открихме промяна в белодробната експресия на ACE2 протеин в мишки модел на CKD, независимо от статуса на хипертония. В допълнение, използването на лечение с ангиотензин рецепторен блокер при мишки модел на CKD не повишава белодробната експресия на ACE2. Тези резултати предполагат хипотезата, че рискът от заболеваемост от COVID-19 може да не е повишен при пациенти с ХБН поради тяхната стабилна белодробна експресия на ACE2. Констатациите предоставят също важни основни научни доказателства, че RAS блокерите могат да се използват безопасно при лечението на пациенти с COVID-19, които имат ХБН.
Материали и методи Животни.Това проучване е проведено в съответствие с насоките на Националния институт по здравеопазване за използване на експериментални животни. Всички експерименти с животни бяха прегледани и одобрени от Комитета за изследване на животните на градския университет в Йокохама (номер на одобрение: FA{{{{10}}}}), които бяха в съответствие с насоките на ARRIVE. Бяха положени усилия за минимизиране на броя на използваните животни и осигуряване на минимално страдание. Мишките бяха настанени в контролирана среда с 12-h цикъл светло-тъмно при температура от 25 градуса. На мишките беше разрешен свободен достъп до храна и вода. CKD модел мишки. Експериментите бяха проведени с използване на 8–9-седмични мъжки C57BL/6 J мишки, след 1-седмична аклиматизация във всички групи. В експеримента с аденин мишките бяха хранени с диета, смесена с 0.2 процента аденин (0.2 процента аденин плюс 0.3 процента NaCl, 3,6 kcal/g, CE{{ 18}}; CLEA, Токио, Япония; аденинова група) или стандартна диета (0,3 процента NaCl, 3,6 kcal/g, CE-2; CLEA; контролна група) за 2 или 4 седмици. В експеримента с АА мишките бяха инжектирани интраперитонеално с АА (3 mg/kg) два пъти седмично в продължение на 4 седмици, последвано от 4-седмичен период на възстановяване; групата с носител се инжектира с носител (75 процента диметилсулфоксид). В експеримента за лечение с олмесартан, мишките бяха разделени на случаен принцип в четири експериментални групи: (1) контролна група; (2) аденинова група, хранени с диета, смесена с 0,2 процента аденин; (3) контролна група олмесартан, лекувана с AT1 рецепторен антагонист олмесартан в питейна вода (4 mg/kg/ден; Daiichi Sankyo Chemical Pharma Co., Ltd, Токио, Япония); и (4) група на аденин-олмесартан, чиито дози са идентични с тези в групи 2 и 3.
Измерване на BP.Систоличното BP се измерва чрез метода на маншета на опашката (BP-Monitor MK-2000; Muromachi Kikai Co., Токио, Япония), както е описано по-рано 42,43. Всички измервания бяха извършени между 9:00 и 14:00 h. Бяха извършени най-малко 10 измервания във всяка мишка и средната стойност беше използвана за анализ.Количествен анализ на обратна транскрипция и полимеразна верижна реакция в реално време.Общата РНК беше извлечена от белия дроб,бъбречнаи тъкан на фаринкса с помощта на ISOGEN (Nippon Gene, Токио, Япония); cDNA се синтезира с помощта на SuperScript III First-Strand System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Количествен анализ на обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция в реално време беше извършен с помощта на система за откриване на последователности ABI PRISM 7000; продуктите на обратната транскрипция се инкубират с TaqMan PCR Master Mix и персонализирана TaqMan сонда (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), както е описано по-рано 44, 45. Използвана е следната TaqMan сонда: ACE2 (Mn01159003_m1). Нивата на тРНК се нормализират до тези на 18S рРНК.
Western blotting анализ.Експресията на протеин се анализира чрез Western blotting, използвайки тъканни хомогенати, както е описано по-рано 45, 46. Накратко, тотален протеинов екстракт се приготвя от тъкани с буфер за проби, съдържащ натриев додецилсулфат. Концентрацията на протеин на всяка проба се измерва с NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific), като се използва говежди серумен албумин като стандарт. Равни количества протеинов екстракт от всяка тъканна проба (белодробна тъкан: 24 ug, бъбречна тъкан: 10 ug) бяха фракционирани върху 5-20 процента полиакриламиден гел (Atto, Токио, Япония). След това отделените протеини се прехвърлят към поливинилиден дифлуоридна мембрана, използвайки iBlot Dry Blotting System (Invitrogen). Мембраните се блокират за 1 час при стайна температура с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 5 процента обезмаслено мляко на прах. Мембраните се инкубират с първични антитела за ACE2 (Ab108252 1:500 [бял дроб] или 1:1000 [бъбрек], Abcam, Cambridge, MA, USA) и -актин (A{{16} }:10 000, Сигма-Олдрич, Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Мембраните се промиват и след това се инкубират с вторични антитела в продължение на 60 минути при стайна температура. Местата на реакциите антитяло-антиген се визуализират чрез усилен хемилуминесцентен субстрат (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Изображенията бяха анализирани количествено с помощта на ChemiDoc Touch (Bio-Rad, Херкулес, Калифорния, САЩ). За да се сравнят нивата на експресия на ACE2 протеин в белия дроб ибъбречни тъканипри нормални мишки се извършва допълнително Western blotting върху същата мембрана (допълнителна фигура S2). Описаното количество протеин беше фракционирано на гелове ((A) бял дроб: 24/10/1 ug, бъбрек: 24/10/1 ug, (B) бял дроб: 24/12 ug , бъбрек: 0.2/0.15/0.1 ug); беше използвано същото първично антитяло за ACE2 (Ab108252 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA). За изследване на специфичността на антитялото беше използван ACE2-селективен блокиращ пептид (ab198988). Western blotting показа единична протеинова лента, която беше премахната от ACE2-селективно блокиращ пептид (допълнителна фигура S3).
Имунохистохимичен анализ.Бял дроб ибъбречнатъкани от мишки се фиксират с 4 процента параформалдехид и впоследствие се поставят в парафин. Срезове с дебелина четири микрометра бяха депарафинизирани и рехидратирани; Извличането на антиген се извършва чрез микровълново нагряване. Срезовете бяха блокирани, за да се намали ендогенната биотинова активност, като се използва блокиращ пероксидаза реагент (Dako, Carpinteria, СА, САЩ) и третирани в продължение на 60 минути с 10 процента нормален кози серум във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. След това срезовете се инкубират с анти-ACE2 антитяло, разредено до 1:500 (Ab15348, Abcam). За да се изследва специфичността на антитялото, имунооцветяването също беше изследвано чрез пропускане на първично Ab и използване на ACE2-селективен блокиращ пептид (ab15352). ACE2 оцветяване в белия дроб ибъбречна тъканs се наблюдава, което не се наблюдава, когато антитялото е било предварително абсорбирано с ACE2-селективно блокиращ пептид (ab15352) или пропускане на ACE2 антитяло. (Допълнителна фигура S4).
CISTANCHE ЩЕ ПОДОБРИ БЪБРЕЧНАТА/БЪБРЕЧНАТА БОЛКА
Биохимичен анализ.След инхалиране на 5 процента изофлуран анестезия, кръвни проби бяха събрани чрез сърдечна пункция в нахранено състояние чрез сърдечни пункции. Опитните животни са умъртвени по хуманен начин след упойка. Пробите от цяла кръв се центрофугират при 3000 rpm (MR-150, Tomy Seiko Co., Ltd., Токио, Япония) при 4 градуса за 10 минути, за да се отдели плазмата. Получените плазмени проби се съхраняват при -80 градуса до употреба. Нивата на плазмения креатинин, BUN, креатинин в урината и албумин в урината бяха измерени с помощта на автоанализатор Hitachi 7180 (Hitachi, Токио, Япония).
Активност на ACE2 в плазмата.Активността на ACE2 беше измерена от TechnoPro R&D Company (Токио, Япония) с помощта на ACE2 Activity Assay Kit (SensoLyte 390) при температура от 27 градуса. Пробите бяха разредени 1:10 с помощта на буфера за анализ, предоставен с комплекта за анализ на активността ACE2. Анализът беше извършен в 384-ямкови плаки. Плазмени проби, само буфер за анализ (фон) или 4-метил-кумарин-7-амид (0,16–5 μM) като референтен стандарт бяха добавени към реакционна плоча OptiPlate-384 F при 10 μL/ямка. Десет, ACE2 субстратен разтвор (0,05 mM 4-метилкумарил-7-амид/Dnp в буфер за анализ) се добавя при 10 μL/ямка. След реакцията интензитетът на флуоресценция (Ex/Em=330 nm/390 nm) се измерва на 5-минутни интервали в продължение на 3 часа с помощта на четец на плаки EnSpire (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Интензитетът на флуоресценция на пробите във всяка времева точка се изчислява от интензитета на флуоресценция на пробите. Наклонът на всяка проба (RFU/min) се определя от линейна апроксимация на диаграмата през периода от 30 до 90 минути след началото на измерването.
Статистически анализ.Данните са изразени като средна стойност±стандартна грешка на средната стойност. Разликите бяха анализирани, както следва. Двупосочен анализ на дисперсията, последван от post hoc анализ на Bonferroni, беше извършен за определяне на разликите във времето между аденин и контролни групи (фигури 1, 2), АА и групи с носител (фигури 3A, B) или аденин и олмесартан групи (фиг. 5, 6 и S1). Използвани са несдвоени t-тестове за определяне на разликите между AA и мишки с носител (фигури 3C–F, 4). P стойности<0.05 were="" considered="" statistically="">
